产品名称：KAPA rRNA去除试剂盒 + KAPA RNA stranded试剂盒
实验名称：利用转录组测序技术分析小鼠脑组织的相关基因Vendor   

实验背景

以往的研究发现成年小鼠各组织中脑的5hmC水平显著高于其他组织。根据以往的研究发现，从胚胎到成年期小鼠脑内的5hmC水平一直较高。为了进一步了解5hmC在脑发育中的重要性。因此通过对小鼠脑中几个组织：小脑、嗅球以及皮质的甲基化水平进行初步分析。在以往的研究中也了解到，甲基化及羟甲基化的高低与转录组有重要联系。为了进一步证明，该实验也对小鼠各个组织中的RNA表达进行了分析。进一步将前期的甲基化结果与其关联，验证小鼠脑中各种RNA表达与甲基化的关系。

生物材料：雌性c57小鼠小脑、皮质、嗅球

实验目的

去除总RNA中rRNA后构建小鼠脑组织RNA文库，分析小鼠脑发育相关基因的表达及其中非编码RNA的作用。

关键词：rRNA去除，链特异性建库，小鼠，脑组织

实验步骤

一. RNA分离

1. RNA 提取并测定浓度
   Trizol法提取总RNA后，用RNA纯化浓缩试剂盒进行纯化。纯化后各样品的浓度为：小鼠小脑：971.5 ng/μl；小鼠嗅球：297.7 ng/μl；小鼠皮质；1715.2 ng/μl。
2. 取1 μg进行后续反应
   根据Qubit的定量，取约 1 μg的全RNA，溶于10 μl无核酶水中 (小鼠小脑：取1 μl；小鼠嗅球：取3.36 μl；小鼠皮质；取0.59 μl)。

Oligo杂交及rRNA去除
注： 1)主要用于总量为100 ng－1μg的总RNA，溶于10 μl无核酸酶水中：2)杂交体系和rRNA去除体系需在实验前事先准备好，并在室温条件下备用；3)由于PCR程序时需要中断并加入后续试剂，需要提前制备好下一步试剂，并在中断时加入。

1. 根据下表先设置好PCR仪的相关程序。PCR程序中涉及逐步降温，应提前设置好并保存备用。
   
   
   
2. 按照下表体系，在PCR管中配置rRNA杂交体系 (体系25 μl，热盖100 °C)
   
   
   
3. 将准备好的样品管放入PCR仪并开始第1步设置的PCR程序。
4. 95 °C 2 min结束后，在PCR程序进行到降温前，将RNase H加入体系，待温度降至45 °C暂停时，将事先配制好的5 μl的去除杂交体系加入PCR管中，开始后续程序，至结束。
   

rRNA去除纯化

1. 准备2.2×磁珠进行纯化，按照下表体系进行配置
   
   
   
2. 将体系转入1.5 ml离心管，枪头吹打混匀。室温下孵育5 min，以保证磁珠和RNA充分结合。
3. 将离心管放置在磁力架上，室温静止5 min，待磁珠吸附在磁力架上，液体澄清后，小心吸取75 μl上清并弃液。
4. 继续将离心管放在磁力架上，加入200 μl的80%乙醇。
   注：垂直加入液体，尽量不要将磁珠吹下管壁。
   
5. 保持离心管不动大于30 s，同时按逆时针或顺时针方向旋转EP管，对磁珠进行清洗后，小心吸弃上清。
6. 继续将离心管放在磁力架上，加入200 μl的80%乙醇。
7. 保持离心管不动大于30 s，同时按逆时针或顺时针方向旋转EP管，对磁珠进行清洗。
8. 在室温开盖晾干磁珠约3-5 min，注意及时查看磁珠的状态，直到乙醇蒸发完毕。

DNase消化
为了将杂交体系中的寡核苷酸以及去除的rRNA清除干净，需要用DNase进行后续处理，参照试剂盒标准配置DNase消化体系。

1. 按下表配制消化反应体系：
   
   
   
2. 枪头吹打混匀，掌上离心机轻微离心后，室温放置3 min以保证RNA可以充分从磁珠上被洗脱下来。
3. 将管子放于磁力架5 min左右，直到磁珠被吸附在磁力架上，即液体澄清后，从管中吸取20 μl液体到新的PCR管中，弃去带有磁珠的管。
4. 按照下述PCR体系进行反应 (体系：2 μl，热盖42 °C)。
   
   
   
5. 完成后立即进行纯化。

DNase消化后纯化

1. 利用2.2×磁珠进行纯化，纯化体系如下表所示，同时将样品转入1.5 ml离心管内：
   
   
   
2. 枪头吹打混匀磁珠，轻甩离心后，室温孵育5 min保证RNA和磁珠充分混合。
3. 将管子放于磁力架5 min左右，直到磁珠被吸附在磁力架上，且液体澄清。加入200 μl的80%乙醇清洗，竖直加入乙醇，防止将磁珠吹下。
4. 管子依旧在磁力架上，此时将管子顺时针或逆时针旋转2圈后。吸弃乙醇，可残留少部分。
5. 继续加入200 μl的80%乙醇清洗，竖直加入乙醇，防止将磁珠吹下。
6. 管子依旧在磁力架上，此时将管子顺时针或逆时针旋转2圈。
7. 吸弃乙醇，需充分吸干,可以黄枪头套用白枪头进一步吸取。
8. 室温下晾干磁珠3-5 min，注意及时查看磁珠的状态，直到乙醇蒸发干净。
9. 取11 μl无核酸酶水溶解RNA。
10. 取1 μl用于浓度测定，10 μl用于后续建库或其他实验。

RNA片段化
注：
1)  此阶段实验样本为RNA，需处于无RNA酶环境内操作，所用仪器，耗材及试剂均需以无核酸酶水配置或经过无核酸酶处理。
2)  需准备冰板，反应体系等样品尽量保持在冰上。

1. 在PCR管内参照下表准备Fragment, Prime Buffer (1×)
   
   
   
2. 吹打混匀样品，保持管在冰板上。
3. PCR 仪中 85 ℃孵育6 min (体系20 μl ，热盖100 °C)。
   注：本次实验中将RNA打断成400 bp片段，选用以上的反应条件，如目标片段为其他大小，请根据说明书选择其他条件。
   
4. 完成后转入冰上，立马进行下一步反应。
   
   

一、二链合成
注：
1) 按说明书操作进行，注意在PCR仪中进行PCR操作时，注意设置热盖 (75 °C)。
2) 此阶段实验样本为RNA，需处于无RNA酶环境内操作，所用仪器，耗材及试剂均需以无核酶水配置或经过无核酶处理。
3) 样品均需在冰上处理，保证低温环境，将样品放在冰板上进行试验操作。

cDNA纯化
注：
1) 此阶段实验样本为cDNA 。
2) 磁珠需要提前半小时拿出，室温下放置再使用。
3) 按照说明书进行实验操作。
4) 反应结束后可立即进行下一步，或选择暂停实验，并将样品用15 μl 1xA尾buffer重悬存于4 °C不超过24 h，不能冷冻。

加A尾
注：样品均需在冰上处理，保证低温环境，将样品放在冰板上进行试验操作。

1. 根据说明书配制反应体系，
   注：如未直接从上一步开始进行试验，选用的反应体系稍有不同。
2. 将上述体系和磁珠结合，吹打混匀后转入PCR管内。
3. PCR仪中设置下列反应程序 (反应体系: 30 μl，热盖60 °C)。
   
   

接头连接

1. 根据说明书配制反应体系，在我们的实验中，起始量为50-200 ng，因此接头使用50 nM。
2. 吹打混匀，PCR仪内20 °C 15 min（体系70 μl，热盖30 °C)。

磁珠纯化（两次）
注：
1) 配制磁珠反应体系时。吹打保证样品充分混匀。
2) 加入 80%乙醇清洗磁珠时，管子应紧贴磁力架再进行旋转; 按顺时针或逆时针旋转两次。
3) 吸弃乙醇时尽量不碰到磁珠，晾干3-5 min，注意磁珠不能太干. 晾干时请注意磁珠状态，对光看时应无反光，也没有干裂为合适的晾干程度。
4) 每次洗涤结束后，加入50 μl无核酸酶水。室温放置2 min将DNA溶解，此操作后，实验可以暂停，并将样品存于4°C，但不超过24小时。

文库扩增
依照说明书进行。

磁珠纯化文库 (一次)

注：
1)  可按照说明书进行，注意事项同“两次磁珠纯化”。
2)  在我们的实验中，洗涤晾干后的磁珠 加入22 μl 无核酸酶水溶解，室温放置2 min，以充分将DNA溶解。而后将管放于磁力架5 min后，待磁珠吸附稳定后。 吸出20 μl样品到新的PCR管中。文库纯化好以后可存于4 °C不超过1周，或在-20 °C条件下不大于一个月。

实验结果

rRNA 去除
符合预期效果，去除量近90%。去除后测定的RNA浓度为：小脑：13.9 ng/μl；嗅球：13.4 ng/μl；皮质：108.4 ng/μl。

文库构建
根据试剂盒要求，50-200 ng起始量用8-12 Cycle，我们选用了10个cycle， 扩增后测浓度，总量约为250 ng。送测序公司库检合格，正常上机测序。

用户使用心得

试剂盒使用总体简单易操作，rRNA去除效果比较好，因rRNA去除后浓度比较低，建议用Qubit测定。PCR热盖温度应选用低温，以免影响酶及磁珠。