实验背景
以往的研究发现成年小鼠各组织中脑的5hmC水平显著高于其他组织。根据以往的研究发现,从胚胎到成年期小鼠脑内的5hmC水平一直较高。为了进一步了解5hmC在脑发育中的重要性。因此通过对小鼠脑中几个组织:小脑、嗅球以及皮质的甲基化水平进行初步分析。在以往的研究中也了解到,甲基化及羟甲基化的高低与转录组有重要联系。为了进一步证明,该实验也对小鼠各个组织中的RNA表达进行了分析。进一步将前期的甲基化结果与其关联,验证小鼠脑中各种RNA表达与甲基化的关系。
生物材料:雌性c57小鼠小脑、皮质、嗅球
实验目的
去除总RNA中rRNA后构建小鼠脑组织RNA文库,分析小鼠脑发育相关基因的表达及其中非编码RNA的作用。
关键词:rRNA去除,链特异性建库,小鼠,脑组织
实验步骤
一. RNA分离
Oligo杂交及rRNA去除 注: 1)主要用于总量为100 ng-1μg的总RNA,溶于10 μl无核酸酶水中:2)杂交体系和rRNA去除体系需在实验前事先准备好,并在室温条件下备用;3)由于PCR程序时需要中断并加入后续试剂,需要提前制备好下一步试剂,并在中断时加入。
rRNA去除纯化
DNase消化 为了将杂交体系中的寡核苷酸以及去除的rRNA清除干净,需要用DNase进行后续处理,参照试剂盒标准配置DNase消化体系。
DNase消化后纯化
RNA片段化 注: 1) 此阶段实验样本为RNA,需处于无RNA酶环境内操作,所用仪器,耗材及试剂均需以无核酸酶水配置或经过无核酸酶处理。 2) 需准备冰板,反应体系等样品尽量保持在冰上。
一、二链合成 注: 1) 按说明书操作进行,注意在PCR仪中进行PCR操作时,注意设置热盖 (75 °C)。 2) 此阶段实验样本为RNA,需处于无RNA酶环境内操作,所用仪器,耗材及试剂均需以无核酶水配置或经过无核酶处理。 3) 样品均需在冰上处理,保证低温环境,将样品放在冰板上进行试验操作。 cDNA纯化 注: 1) 此阶段实验样本为cDNA 。 2) 磁珠需要提前半小时拿出,室温下放置再使用。 3) 按照说明书进行实验操作。 4) 反应结束后可立即进行下一步,或选择暂停实验,并将样品用15 μl 1xA尾buffer重悬存于4 °C不超过24 h,不能冷冻。 加A尾 注:样品均需在冰上处理,保证低温环境,将样品放在冰板上进行试验操作。
接头连接
磁珠纯化(两次) 注: 1) 配制磁珠反应体系时。吹打保证样品充分混匀。 2) 加入 80%乙醇清洗磁珠时,管子应紧贴磁力架再进行旋转; 按顺时针或逆时针旋转两次。 3) 吸弃乙醇时尽量不碰到磁珠,晾干3-5 min,注意磁珠不能太干. 晾干时请注意磁珠状态,对光看时应无反光,也没有干裂为合适的晾干程度。 4) 每次洗涤结束后,加入50 μl无核酸酶水。室温放置2 min将DNA溶解,此操作后,实验可以暂停,并将样品存于4°C,但不超过24小时。
文库扩增 依照说明书进行。 磁珠纯化文库 (一次)
注: 1) 可按照说明书进行,注意事项同“两次磁珠纯化”。 2) 在我们的实验中,洗涤晾干后的磁珠 加入22 μl 无核酸酶水溶解,室温放置2 min,以充分将DNA溶解。而后将管放于磁力架5 min后,待磁珠吸附稳定后。 吸出20 μl样品到新的PCR管中。文库纯化好以后可存于4 °C不超过1周,或在-20 °C条件下不大于一个月。
实验结果
rRNA 去除 符合预期效果,去除量近90%。去除后测定的RNA浓度为:小脑:13.9 ng/μl;嗅球:13.4 ng/μl;皮质:108.4 ng/μl。 文库构建 根据试剂盒要求,50-200 ng起始量用8-12 Cycle,我们选用了10个cycle, 扩增后测浓度,总量约为250 ng。送测序公司库检合格,正常上机测序。
用户使用心得
试剂盒使用总体简单易操作,rRNA去除效果比较好,因rRNA去除后浓度比较低,建议用Qubit测定。PCR热盖温度应选用低温,以免影响酶及磁珠。
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