实验背景
高等植物叶片通过光合作用定大气中的CO2产生糖, 为其他组织器官提供能源和碳源,固定的碳以糖尤其是蔗糖的形式分配到植物各组织器官中,糖的转运主要由转运蛋白控制,对于提高农作物和林木的生产力具有非常重要的意义。我们的课题主要关注光同化产物分配的机理,通过分子遗传,分子工程学手段,为粮食,纤维,木材等产量提高提供分子生物学基础。
生物材料: 拟南芥地上部
实验目的
构建拟南芥mRNA转录组, 探究参与调控糖转运,代谢等相关基因。
关键词 : 二代测序,拟南芥,mRNA,糖代谢
实验步骤
一、 耗材及仪器准备
四、 建库流程 注意事项:
mRNA抓取:此步骤主要利用带有T碱基的磁珠进行mRNA的纯化
mRNA洗脱、酶系打断、接上随机引物:洗脱后的mRNA将会被酶切割为300 bp的小片段并连接上引物
合成第一链cDNA:利用随机引物将小片段mRNA反转录为第一链cDNA
合成第二链cDNA:将cDNA和RNA混合的双链转为双链cDNA (dscDNA)
纯化:在此步骤中需要利用1.8X KAPA Pure beads进行纯化。
加A尾:于双链cDNA的尾端加上A碱基
接头连接:接头上带有T碱基,利用T-A连接的原理连接接头与双链cDNA
连接后纯化:由于未结合cDNA的接头会形成二聚体影响文库质量,此步骤利用1X KAPA Pure Beads移除小片段DNA,共进行两次纯化
扩增:利用接头上的通用序列以通用引物进行文库扩增,需依照样品量调整扩增循环
纯化:此步骤利用1x KAPA Pure Beads再次移除小片段DNA (引物二聚体、接头二聚体…等)
实验结果
起始量1000 ng 总RNA,经mRNA 抓取磁珠后进行文库构建后,经8个PCR循环扩增获得目标文库,库检质量合格,其中一个样品文库构建质量结果结果检测示例图见下图3。 图3. 文库检测结果图
用户使用心得
相对Illumina的系统,减少了许多DNA Pure beads的用量(许多步骤可重複使用磁珠),进而节省总试验经费。
If you have any questions/comments about this protocol, you are highly recommended to post here. We will invite the authors of this protocol as well as some of its users to address your questions/comments. To make it easier for them to help you, you are encouraged to post your data including images for the troubleshooting.