产品名称:KAPA Stranded mRNA-Seq Kit Illumina®
实验名称:利用转录组测序技术分析拟南芥糖代谢相关基因   

KAPA建库试剂盒在通用方法学中的应用
        下一代测序技术(NGS),又称为大规模平行测序技术,通常指第二代和第三代测序技术,与一代测序技术相比,其在测序速度以及成本上的优势使得该技术在各个领域得以迅速应用。
        按所测序核酸分子的类型不同,NGS文库类型可分为DNA文库—全基因组测序 (WGS)、全外显子组测序 (WES),染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq);RNA 文库—转录组测序, RNA免疫沉淀测序 (RIP-seq)。KAPA NGS系列产品可覆盖所有类型文库构建应用。
        转录组研究目前是探寻基因表达水平的主要方法,以定位在不同基因位置上的RNA丰度来展示基因表达水平,进而研究不同实验条件、不同组织或细胞等之间的差异表达的基因,下一步也可对这些基因的功能、富集通路等分子机制进行深入的研究。随着二代测序技术的发展,测序成本大幅度降低,大规模转录组测序 (RNA-seq) 已经成为转录组研究的重要方法。KAPA的Stranded mRNA-Seq Kit建库试剂盒基于真核生物mRNA含有polyA尾的特性,用磁珠富集纯化,进而进行后续的文库构建。本文中利用Stranded mRNA-Seq Kit建库试剂盒构建拟南芥地上部mRNA转录组文库,通过转录组分析挖掘参与糖转运,代谢途径中的相关基因。

实验背景

高等植物叶片通过光合作用定大气中的CO2产生糖, 为其他组织器官提供能源和碳源,固定的碳以糖尤其是蔗糖的形式分配到植物各组织器官中,糖的转运主要由转运蛋白控制,对于提高农作物和林木的生产力具有非常重要的意义。我们的课题主要关注光同化产物分配的机理,通过分子遗传,分子工程学手段,为粮食,纤维,木材等产量提高提供分子生物学基础。

生物材料: 拟南芥地上部

实验目的

构建拟南芥mRNA转录组, 探究参与调控糖转运,代谢等相关基因。

关键词 : 二代测序,拟南芥,mRNA,糖代谢

实验步骤

一、 耗材及仪器准备

  1. 单道移液器 (1000 µL、200 µL、20 µL 10 µL及2 µL )
  2. 超低吸附滤芯吸头 (1000 µL、200 µL、20 µL及10 µL)
  3. 超低吸附EP馆 (1.5 mL )
  4. Qubit分析管 
  5. 96孔无裙边反应板 
  6. 96孔硅胶上盖 
  7. 96孔板磁力架
  8. 涡漩震荡仪
  9. 离心机
  10. PCR仪
  11. Nanodrop及Qubit
  12. 冰板 (96孔)

二、 试剂准备
  1. RNeasy PowerPlant 试剂盒(50) (Qiagen,货号:13500-50)
  2. Turbo DNA free 试剂盒(50) (Invitrogen,货号:AM1907)
  3. KAPA Stranded mRNA-Seq 试剂盒 (Roche,货号:KK8420)
  4. KAPA Pure Beads (5 mL) (Roche,货号:KK8000)
  5. KAPA Dual-Indexed Adapter Kit (15 µM) (Roche,货号:KK8722)
  6. 无核酸水 (无RNase水)
  7. 80%酒精 (当天现配)
  8. 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)

三、 总RNA提取
  1. RNeasy PowerPlant 试剂盒提取实验样品。收集各培养基中的拟南芥样品,于液氮中以研磨棒研磨均匀后依序加入试剂提取总RNA,样品以无核酸水洗脱。
  2. 取少量样品以nanodrop检测浓度并以TAE胶检测RNA品质 (图 1)及chip检测RNA的完整性 (见检测示例图2)。


    图1. RNA 质量检测TAE胶图


    图2. RNA完整性chip检测图

  3. 以Turbo DNA free 试剂盒去除样品中的DNA,再次以nanodrop检测浓度,保存于-80 °C备用。


四、 建库流程
        注意事项:

       1)
建库约耗时6-8小时,依据样品数量略有变化。
       2)
纯化磁珠购入后,建议先以涡漩震荡器混匀后分装为1 mL小管,每次实验开始时取出一管置于常温备用(当日结束实验再放回4 °C冰箱长期保存)。
       3)
每次使用磁珠前,务必混合均匀后再吸取。


mRNA抓取:此步骤主要利用带有T碱基的磁珠进行mRNA的纯化

  1. 取1000 ng 总RNA样品调整为50 µL,置于冰上备用。
  2. mRNA抓取磁珠需要以mRNA磁珠结合缓冲液清洗后方可使用。
  3. 先将96孔板放上磁力架,依样品数量准备mRNA抓取磁珠,每管加入50 µL混匀的mRNA抓取磁珠。
  4. 磁珠与保存液分开后,移除澄清的液体并加入50 µL mRNA磁珠抓取缓冲液。
  5. 将96孔板移出磁力架,以枪头吸打混合均匀再放回磁力架。
  6. 再次移除澄清液体并加入50 µL mRNA磁珠抓取缓冲液。
  7. 将96孔板移出磁力架,以枪头吸打混合均匀。此时磁珠已具备mRNA抓取能力。
  8. 将各组总RNA样品(1000 ng in 50 µL)依序放入含有混合均匀磁珠的管中。
  9. 将96孔板覆上硅胶盖封膜再放入已预热好的PCR仪中,65 °C 2分钟再于20 °C冷却5分钟。
  10. 当磁珠与目标mRNA片段结合后,将96孔板放上磁力架,当磁珠与磁力架结合后,移除澄清液体。
  11. 各管加入100 µL的mRNA清洗缓冲液,将96孔板移出磁力架。各管以枪头吸打混匀。
  12. 将96孔板放上磁力架,当磁珠与磁力架结合后,移除澄清液体。
  13. 以50 µL无核酸水洗脱各管中的mRNA。
  14. 进行第二次磁珠的mRNA抓取。
  15. 第二次抓取采用较高的温度,于70 °C反应2分钟再于20 °C冷却5分钟。
  16. 在磁珠结合后,于各管中加入50 µL mRNA磁珠抓取缓衝液并以枪头吸打混匀。
  17. 混合均匀后,放回PCR仪于20 °C反应5分钟。
  18. 此时磁珠与目标mRNA片段已再度结合后,将96孔板放上磁力架,当磁珠与磁力架结合后,移除澄清液体。
  19. 各管加入200 µL的mRNA清洗缓衝液,将96孔板移出磁力架。各管以枪头吸打混匀。
  20. 将96孔板放上磁力架,当磁珠与磁力架结合后,移除澄清液体。
    注意: 残留的清洗缓冲液会影响后续cDNA的合成,务必将所有液体彻底移除。


mRNA洗脱、酶系打断、接上随机引物:洗脱后的mRNA将会被酶切割为300 bp的小片段并连接上引物

  1. 由于磁珠过度干燥会造成文库制备产量大幅下降。在mRNA抓取最后一步移除澄清液体前,要先将此步骤的体系(步骤2)混合备用。
  2. 洗脱、酶系打断及随机引物已在试剂盒中混合成2×体系,只需要在冰上依比例以无RNase水混合为1×工作浓度。
    • 11 µL 无RNase水
    • 11 µL Fragment, Prime and Elute Buffer 
  3. 每管加入22 µL的反应液,依据目标片端大小选择反应时间及温度。
  4. 我们实验中的目标片段大小为201-300 bp,故将反应体系置于PCR仪于94 °C反应6分钟。
  5. 6分钟后立即将96孔板放上磁力架,切勿置于冰上。 (当样品降温时,带有PolyA尾的RNA会形成杂合物)
  6. 每一管取出20 µL的澄清液体置于冰板上并立即进行反转录。


合成第一链cDNA:利用随机引物将小片段mRNA反转录为第一链cDNA

  1. 在冰板上组装cDNA合成所需试剂。
    • 20 µL 带有随机引物的短片段mRNA (已在96孔板中)
    • 10 µL 第一链cDNA合成反应液
  2. 每管加入10 µL 试剂,吸打混匀数次。
  3. 将96孔板放入PCR仪,25 °C 10分钟使Primer延伸,再于42 °C合成第一链cDNA,最后以70 °C 15分钟使酶失活,4 °C 保持。


合成第二链cDNA:将cDNA和RNA混合的双链转为双链cDNA (dscDNA)

  1. 在冰板上预制第二链cDNA合成所需试剂:
    • 30 µL cDNA:RNA混合的双链 (已在96孔板中)
    • 30 µL 第二链cDNA合成反应液
  2. 每管加入30 µL 试剂,以枪头吸打混匀数次
  3. 将96孔板放入PCR仪,16 °C60分钟合成第二链的cDNA,4 °C 保持。


纯化:在此步骤中需要利用1.8X KAPA Pure beads进行纯化。

  1. 从PCR仪取出96孔板,加入KAPA Pure beads进行纯化:
    • 60 µL 双链cDNA
    • 108 µL KAPA Pure beads
  2. 吸打混匀数次,将96孔板置于室温10分钟。
  3. 将96孔板放上磁力架,待溶液变澄清时移除160 µL上清液。
  4. 每管加入200 µL 80%乙醇。(需从无磁珠侧的管壁缓慢加入,不可以酒精直接冲洗磁珠)
  5. 等待30秒后,小心的移除乙醇。
  6. 重复步骤4和5。
  7. 等待5分钟,当磁珠表面乙醇蒸发,立刻加上A尾的反应液 (A-tailing)。


加A尾:于双链cDNA的尾端加上A碱基

  1. 将30 µL 的反应液加上已挥发乙醇的磁珠,吸打混匀。
  2. 将96孔板放入PCR仪,于30 °C30分钟加上A尾,再以60 °C处理30分钟使酶失活。


接头连接:接头上带有T碱基,利用T-A连接的原理连接接头与双链cDNA

  1. 立即进行接头连接,接头需依照样品起始量调整浓度。
  2. 本次试验起始量为1000 ng,故将接头调整为700 nM的母液,实际工作浓度为50 nM。
  3. 混合接头连接反应液:
    • 30 µL加A尾的DNA
    • 35 µL接头连接混合液
    • 5 µL稀释后的接头母液 (700 nM)
  4. 以枪头吸打混匀,放入PCR仪于20 °C反应15分钟。


连接后纯化:由于未结合cDNA的接头会形成二聚体影响文库质量,此步骤利用1X KAPA Pure Beads移除小片段DNA,共进行两次纯化

  1. 预制纯化所需试剂
    • 70 µL带有接头及DNA的磁珠
    • 70 µL PEG/Na 混合溶液
  2. 以枪头吸打混匀。
  3. 置于室温10分钟。
  4. 将96孔板置于磁力架上。
  5. 以枪头移除135 µL澄清液体。
  6. 每管加入200 µL 80%乙醇 (从远离磁珠侧的管壁加入)。
  7. 等待至少30秒,小心移除乙醇。若有剩馀少量乙醇,可用10 µL枪头吸出。
  8. 在室温条件下等待乙醇挥发。(约3-5分钟)
  9. 将96孔板移出磁力架,即刻加入50 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
  10. 在室温等待2分钟,DNA会溶于Tris缓衝液中。
  11. 将96孔板放回磁力架。
  12. 再度重複上述步骤(1-8),再以22 µL10 mM Tris-HCl (pH 8.0)回溶DNA(室温2分钟)。
  13. 将6孔板放回磁力架。
  14. 吸取10 µL澄清液体(注意不可吸入任何磁珠)。


扩增:利用接头上的通用序列以通用引物进行文库扩增,需依照样品量调整扩增循环

  1. 预制扩增所需反应试剂
    • 20 µL纯化后带有接头的DNA片段
    • 30 µL文库扩增试剂混合液
  2. 放入PCR仪进行扩增
    • 98 °C 45秒 初始变性 (1次循环)
    • 98 °C 15秒 变性
    • 60 °C 30秒 退火
    • 72 °C 30秒 延伸
    (上述三步骤循环数依样品量决定,本次试验为8个循环)
    • 72 °C 5分钟 最终延伸
    • 4 °C 保持
  3. 立刻进行纯化


纯化:此步骤利用1x KAPA Pure Beads再次移除小片段DNA (引物二聚体、接头二聚体…等)

  1. 预制纯化所需试剂
    • 50 µL纯化后带有接头的DNA片段
    • 50 µLKAPA Pure Beads
  2. 以枪头吸打混匀,室温等待10分钟。
  3. 将96孔板放上磁力架,待溶液澄清,吸去澄清液体。
  4. 加入200 µL80% 乙醇 (从远离磁珠侧的管壁加入)。
  5. 等待至少30秒,小心移除乙醇。若有剩余少量乙醇,可用10 µL枪头吸出。
  6. 在室温条件下等待挥发 (约3-5分钟)。
  7. 当磁珠块边缘出现裂痕,将96孔板移出磁力架,即刻加入22 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
  8. 在室温等待2分钟,DNA会溶于Tris缓衝液中。
  9. 将96孔板放回磁力架,待溶液变为透明。
  10. 每管取出20 µL澄清清液 (注意不可吸入磁珠) 放入1.5 mL低吸附 EP管中。
  11. 取出1 µL样品,以Qubit检测文库中DNA浓度。
  12. 若欲检测文库质量,可使用Bioanalyser配合Agilent DNA 1000 试剂组。此法可确认文库是否符合预期片段大小及接头二聚体是否确实被移除。
  13. 将样品标记并置于-20 °C冰箱中保存即可以 Illumina测序仪进行文库测序。

实验结果

起始量1000 ng 总RNA,经mRNA 抓取磁珠后进行文库构建后,经8个PCR循环扩增获得目标文库,库检质量合格,其中一个样品文库构建质量结果结果检测示例图见下图3。


图3. 文库检测结果图

用户使用心得

相对Illumina的系统,减少了许多DNA Pure beads的用量(许多步骤可重複使用磁珠),进而节省总试验经费。

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
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