产品名称:KAPA mRNA HyperPrep建库试剂盒
实验名称:利用转录组测序技术分析线虫突变体纤毛形成和维持的相关基因   

KAPA建库试剂盒在通用方法学中的应用
        下一代测序技术(NGS),又称为大规模平行测序技术,通常指第二代和第三代测序技术,与一代测序技术相比,其在测序速度以及成本上的优势使得该技术在各个领域得以迅速应用。
        按所测序核酸分子的类型不同,NGS文库类型可分为DNA 文库—全基因组测序 (WGS)、全外显子组测序 (WES),染色质免疫沉淀测序 (ChIP-seq) ; RNA 文库—转录组测序,RNA免疫沉淀测序 (RIP-seq)。KAPA NGS系列产品可覆盖所有类型文库构建应用。
        转录组研究目前是探寻基因表达水平的主要方法,用定位在不同基因位置上的RNA丰度来展示基因表达水平,进而研究不同实验条件、不同组织或细胞等之间的差异表达的基因,下一步也可对这些基因的功能、富集通路等分子机制进行深入的研究。随着二代测序技术的发展,测序成本大幅度降低,大规模转录组测序 (RNA-seq)已经成为转录组研究的重要方法。KAPA的mRNA HyperPrep建库试剂盒基于真核生物mRNA含有polyA尾的特性,用磁珠富集纯化,进而进行后续的文库构建。本文中利用KAPA mRNA HyperPrep建库试剂盒构建线虫纤毛相关突变体的转录组文库,通过转录组分析发掘控制相应表型的基因。

研究背景

纤毛和鞭毛是从单细胞藻类到高等动物中保守的膜细胞器。它的形成和维持依赖于微管马达蛋白驱动的双向纤毛运输,同时纤毛功能的失调与许多人类疾病密切相关,统称为纤毛病。尽管目前有许多关于纤毛的调节机制的研究,但是关于它的具体调节机制以及详细的功能还不是特别清楚。为了进一步深入地探讨纤毛的形成和维持过程,我们利用模式生物秀丽隐杆线虫开展了研究。
生物材料:L1时期线虫突变体
起始总RNA量:~300 ng RNA

实验目的

构建线虫相关突变体mRNA文库,以对于线虫纤毛突变体转录组进行分析,为后续的挖掘控制相应表型的基因提供数据支持。
关键词:RNA,二代测序,线虫

实验步骤

一、RNA提取

整个流程参考了Trizol官网上给的RNA提取步骤。
注意事项:规范操作,保持实验台的清洁,使用核酸free的枪头和离心管,戴口罩,每一步都记着加RNA酶抑制剂,尽量防止RNA的降解。

二、建库流程

1)  全实验流程大概需要6 h左右。根据样品的数量,时间会有所不同;
2)  第一次使用前请仔细阅读KAPA mRNA HyperPrep建库试剂盒说明;
3)  确保RNA没有降解;
4)  纯化磁珠请提前拿出来 (避光),放在室温半小时后使用;
5)  按照说明书进行逐步操作,本文中将不再详述,下文关键步骤的质控进行了举例说明。

  1.  检测RNA完整度
    实验之前使用Agilent 2100进行RNA完整度的检测,注意:这一步非常重要,如果RNA浓度比较高的话也可以通过琼脂糖凝胶电泳进行检测 (比较跑胶条带中28s和18s rRNA条带的亮度比值)。由于在我的实验中用到的都是L1时期的线虫,提取出来的RNA总量相对较低,所以我都是用Agilent 2100进行RNA完整度的检测。以下是我的一个样品的2100结果 (图1)。


    图1. 利用Agilent 2100进行RNA完整度检测结果图

    以上结果说明:这是一个可以用于下面进行RNA建库的样品。在该结果中RIN>7代表该RNA样品完整度很好,可以进行下面的实验。
  2. mRNA抓取
    该实验过程直接参考说明书及上面的注意事项即可;在我们的实验中,为了提高mRNA抓取的质量,一般会提前半小时把需要用到的磁珠和buffer放在室温进行平衡。
  3. mRNA片段化
    由于后续文库的测序是进行双端150 bp测序,在我们的实验中一般会将片段打断在200-300 bp。第一次做的时候参考说明书用94 °C,6 min的条件进行打断,图2是进行文库扩增,纯化之后的Agilent 2100测定结果示意图。


    图2. RNA打断 6 min后利用Agilent 2100检测RNA结果图

    可以看到使用这个条件进行打断的话,我得到的文库大小在250 bp左右。因为我们用到的接头的大小在120 bp,所以在我的实验中参考说明书的条件得到的片段大小在130 bp左右,相对而言是偏小的。在后续实验中,我对这一步进行了调整,使用条件为94 °C,5 min。使用该条件得到的文库如图3。


    3. 文库检测结果图

    图3显示,我们得到的文库大小在400 bp左右,相当于片段化之后RNA的大小在280 bp左右。因此,在实验过程中,使用该条件进行片段化RNA。
  4. 文库扩增:
    文库扩增循环数可根据说明书建议进行操作,但由于前面实验过程中样品损失的不同,个人的差异会比较大。在我的实验中中,使用300 ng总量RNA建库的话,我一般采用9个循环数进行扩增。
  5. 磁珠纯化文库:
    注意:请提前半小时将纯化用的磁珠放置在室温平衡。

实验结果

用于建库的起始总RNA为300 ng,经9个PCR循环扩增,使用20 μl Tris-Hcl溶解的条件下,得到的文库浓度一般在8 ng/μl左右,是符合测序标准。

用户使用心得

本试剂盒使用简单易操作,末端补平及加A可同时进行。且加A及后续接头的连接可以一管完成,简单方便,非常适用于样品量比较低的样品。
<新用户使用建议>:1) 通读说明书,明确每一步中要用的体积和浓度后再进行试验,同时在下一步实验开始前做好规划,比如在PCR过程中,可以开始准备下一步的反应体系;2) 清洗磁珠时,管子应紧贴磁力架;3) 用乙醇洗涤磁珠的过程中,注意枪头不要碰到磁珠,可能会粘走磁珠;4) 全过程使用进口的EP及PCR管。

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
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