产品名称：KAPA HyperPlus建库试剂盒
实验名称：构建小鼠外胚层基因组DNA文库进行5hmC分析Vendor   

研究背景

以往的研究对小鼠原肠胚期即E7.5时期，各个胚层的甲基化、羟甲基化水平并不明确，本实验的目标是在基因组水平上进行验证。同时利用全基因组测序与TAB-seq数据相对比，找出甲基化、羟甲基化主要在基因组、基因功能区域的变化及其可能作用。

生物材料：小鼠E7.5胚胎
起始总DNA量：~120 ng基因组DNA

实验目的

构建小鼠E7.5外胚层基因组文库，用于后期5hmC相关分析。

关键词：DNA，二代测序，纯化，单细胞

实验步骤

一、耗材及仪器准备

1. 各型号枪头
   
2. 各型号EP管
3. 磁力架 (推荐使用DynaMag™-Spin magnet 6孔架，货号：12320D)
   

   

4. 涡旋震荡仪
5. 离心机
6. PCR仪
7. 流式细胞仪
8. Nanodrop2000或Qubit
9. 冰板－冷冻管模块 (2 ml)

1. KAPA hyperplus试剂盒 (KK8510-8515)
2. 无核酶水
3. QIAGEN DNA Mini Kit

流式分选小鼠E7.5胚胎外胚层细胞，并利用QIAGEN DNA Mini Kit提取基因组DNA，用无核酶水洗脱DNA。Qubit测定DNA浓度 (5.98 ng/μl)。根据试剂盒建议，取20 μl即119.6 ng进行建库。
DNA提取全过程为3小时左右，提取后可于-20 ℃保存一个月，长期存放需要存于-80 ℃。

四、建库流程

注：
1)  全实验流程大概需要1.5~3 h。根据样品的数量，时间会有所不同。
2)  第一次使用前请仔细阅读KAPA HyperPlus说明书附录2；
3)  确定DNA是否含有EDTA；
4)  纯化磁珠建议提前拿出来放在室温半小时后再使用。

1. 预冷PCR仪至4 °C
   
   

 酶系打断

2. 冰上配制反应体系：
   

   20 μl	DNA (119.6 ng DNA)
   15 μl	无核酶水
   5 μl	KAPA Frag buffer
   10 μl	KAPA Frag Enzyme

   注: 本实验中提取的DNA 用无核酶水溶解，因此样品中不含EDTA。如样品中含EDTA时，将DNA样品体积调整为30 μl，并加入5 μl调节溶液(Conditioning Solution)。
3. 枪头吹打混匀后，放于冰上，立即进行下一步。
4. 在提前冷却至4 °C在PCR仪中，按照下面程序 进行设定 (体系50 μl，热盖45 °C)
   

   4 °C	待PCR仪降温，时长与PCR性能有关
   37 °C	10 min (根据测序仪器需要300-400bp片段，于是根据说明书，选择350 bp，处理10 min)
   4 °C	forever

5. 结束后将样本转入冰上，继续末端修复及加A尾。
   
   

 末端修复及加A尾

6. 在PCR管内按下表所示配制反应体系：
   

   片段化后的DNA	50 μl
   End repair& A-tailing buffe	7 μl
   End repair& A-tailing Enzyme mix	3 μl
   总体积	60 μl

   注：建议准备冰盒和冰板，将buffer提前拿出在室温溶解，mix保持在冰板上，buffer溶解后管内会有各种盐离子沉淀，需要用枪头多次吹打混匀，保证buffer是澄清液体再使用。
7. 将PCR管内液体充分混匀后轻微离心后放在冰板上，待进行下一步PCR加A。
8. 按照下表设置PCR仪程序 (体系60 μl；热盖85 °C)
   

   65 °C	30 min
   4 °C	Forever

接头连接

9. 溶解接头储液至15 μM (根据试剂盒说明书的表4，起始量250 ng选用15 μM的储液浓度) 。
10. 在完成末端修复及加A反应的PCR管中配制以下反应体系：
    

    完成加A反应的样品	60 μl
    15 μM adapter stock	5 μl
    无核酶水	5 μl
    Ligation buffer	30 μl
    DNA ligase	10 μl
    总体积：	100 μl

    注：将Ligation buffer提前拿出在室温溶解，使用前用枪头多次吹打混匀，确保buffer是澄清液体再使用。
11. 将PCR管内液体充分混匀后轻微离心后放在冰板上，开始PCR。
12. PCR仪内20 °C 15 min (体系110 μl，热盖30 °C)
    注：对于微量样品，建议加长连接时间 (20 °C 4 h或4 °C过夜)，增加连接时间有可能导致引物而具体，因此接头浓度需要自己调整和优化。
13. 立即进行下一步：纯化。
    
    

连接后纯化

14. 将样品转入1.5 ml管内用0.8X磁珠进行纯化：
    

    Adapter连接后的样品	110 μl
    KAPA Pure Beads	88 μl
    总体积	198 μl

15. 吹打混匀或用轻微涡旋。
16. 室温下放置5~15 min保证样品和磁珠充分结合。
17. 放于磁力架上，5 min后待样品管澄清。
18. 小心吸弃上清。
19. 将管子依旧放在磁力架上，向管中竖直加入200 μl 80%乙醇，不要碰到磁珠。
20. 在磁力架上停留大于30 s。
    注：按顺时针或逆时针旋转两次。 (保证磁珠和酒精充分接触)
21. 弃去酒精。
22. 将管子依旧放在磁力架上，向管中竖直加入200 μl 80%乙醇。
23. 在磁力架上停留大于30 s。
    注：按顺时针或逆时针旋转两次。
24. 弃去酒精，尽量吸净酒精，不要带走磁珠。
25. 并在室温下放置3~5 min，晾干酒精。
    注：吸弃酒精时尽量不碰到磁珠，晾干时注意磁珠不能太干 。
26. 取下离心管。加入50 μl 无核酶水。(防止盐离子影响后续实验中酶及缓冲液的作用效果)
27. 室温放置2 min将DNA溶解。
    注：此处实验可暂停，但样品在4 °C保存不要超过24小时。
    
    

文库扩增

28. 配制文库扩增体系：
    

    KAPA HiFi Hot start ready mix (2×)	25 μl
    KAPA library amplification primer mix (10×)	5 μl
    Adapter-ligated library	20 μl
    总体积	50 μl

29. 吹打混匀并轻微离心
30. 按照下表的程序设置PCR仪
    

扩增后纯化

31. 将样品转入1.5 ml管内用1× 磁珠按照下表进行配置：
    

    文库扩增产物	50 μl
    KAPA pure beads	50 μl
    总体积	100 μl

32. 吹打混匀或用轻微涡旋。
33. 室温下5~15 min保证样品和磁珠充分结合。
34. 放于磁力架，5 min后待样品管澄清；小心吸弃上清。
35. 将管子放回磁力架上，向管中竖直加入200 μl 80%乙醇，注意枪头不要碰到磁珠。
36. 在磁力架上停留大于30 s。
    注：按顺时针或逆时针旋转两次。
37. 弃去酒精。
38. 将管子依旧放在磁力架上，向管中竖直加入200 μl 80%乙醇
39. 在磁力架上停留大于30 s。
    注：按顺时针或逆时针旋转两次。
40. 弃去酒精，尽量吸净酒精，不要带走磁珠。
41. 并在室温下放置3~5 min，晾干酒精。
42. 取下离心管。加入50 μl无核酶水。
43. 室温放置2 min将DNA溶解 (此处可以停止，并将样品存于4度不超过24小时)。

实验结果

文库扩增6个循环后，进行库检，达到上机测序的标准。

用户使用心得

本试剂盒使用简单易操作，末端补平及加A可同时进行。且加A及后续接头的连接可以一管完成，简单方便，非常适用于样品量比较低的样品。
<新用户使用建议>：1) 通读说明书，明确每一步中要用的体积和浓度后再进行试验，同时在下一步实验开始前做好规划，比如在PCR过程中，可以开始准备下一步的反应体系；2) 清洗磁珠时，管子应紧贴磁力架；3) 用酒精洗涤磁珠的过程中，注意枪头不要碰到磁珠，可能会粘走磁珠；4) 全过程使用进口的EP及PCR管。

对说明书的修改

溶解DNA均采用商品化的无核酶水。