研究背景
以往的研究对小鼠原肠胚期即E7.5时期,各个胚层的甲基化、羟甲基化水平并不明确,本实验的目标是在基因组水平上进行验证。同时利用全基因组测序与TAB-seq数据相对比,找出甲基化、羟甲基化主要在基因组、基因功能区域的变化及其可能作用。
生物材料:小鼠E7.5胚胎 起始总DNA量:~120 ng基因组DNA
实验目的
构建小鼠E7.5外胚层基因组文库,用于后期5hmC相关分析。
关键词:DNA,二代测序,纯化,单细胞
实验步骤
一、耗材及仪器准备
流式分选小鼠E7.5胚胎外胚层细胞,并利用QIAGEN DNA Mini Kit提取基因组DNA,用无核酶水洗脱DNA。Qubit测定DNA浓度 (5.98 ng/μl)。根据试剂盒建议,取20 μl即119.6 ng进行建库。 DNA提取全过程为3小时左右,提取后可于-20 ℃保存一个月,长期存放需要存于-80 ℃。
四、建库流程
注: 1) 全实验流程大概需要1.5~3 h。根据样品的数量,时间会有所不同。 2) 第一次使用前请仔细阅读KAPA HyperPlus说明书附录2; 3) 确定DNA是否含有EDTA; 4) 纯化磁珠建议提前拿出来放在室温半小时后再使用。
酶系打断
末端修复及加A尾
接头连接
连接后纯化
文库扩增
扩增后纯化
实验结果
文库扩增6个循环后,进行库检,达到上机测序的标准。
用户使用心得
本试剂盒使用简单易操作,末端补平及加A可同时进行。且加A及后续接头的连接可以一管完成,简单方便,非常适用于样品量比较低的样品。 <新用户使用建议>:1) 通读说明书,明确每一步中要用的体积和浓度后再进行试验,同时在下一步实验开始前做好规划,比如在PCR过程中,可以开始准备下一步的反应体系;2) 清洗磁珠时,管子应紧贴磁力架;3) 用酒精洗涤磁珠的过程中,注意枪头不要碰到磁珠,可能会粘走磁珠;4) 全过程使用进口的EP及PCR管。
对说明书的修改
溶解DNA均采用商品化的无核酶水。
If you have any questions/comments about this protocol, you are highly recommended to post here. We will invite the authors of this protocol as well as some of its users to address your questions/comments. To make it easier for them to help you, you are encouraged to post your data including images for the troubleshooting.