实验名称：利用二代测序技术检测甲状腺癌症病人基因突变
产品名称：KAPA hyperplus建库试剂盒   

[KAPA NGS产品在肿瘤研究中的应用] 下一代测序技术 (NGS)，又称为大规模平行测序技术，与一代测序技术相比，其在测序速度以及成本上的优势使得该技术在肿瘤诊断 (肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌) 及个体化用药治疗上的应用变为可能。
        构建高质量文库是运用NGS技术进行科学/临床研究的第一步也是非常关键的一步。进行肿瘤研究的文库类型主要有以下5种：全基因组测序 (WGS) (针对DNA)、全外显子组测序 (WES) (针对DNA)、全转录组测序 (针对RNA的RNA-seq)、 表观组测序 (甲基化及ChIP-seq)和靶向靶标测序 (DNA和RNA)。
        在科研及临床研究中，用于肿瘤相关研究的原始样品主要包括：FFPE样品、体液、单细胞、游离核酸等。从样品中分离出的用于文库构建的核酸起始样品量比较低 (通常1 ng 到几百ng 不等)，且核酸分子质量不高 (降解、损伤)。这些都对构建达到测序标准的高质量文库提出了挑战。
        Roche KAPA文库制备试剂为通过NGS进行肿瘤研究提供了整套解决方案 (Roche Dialog，罗氏诊断在华推广KAPA NGS新一代测序系列产品完善基因检测解决方案)。KAPA人类基因组DNA定量及QC试剂盒可以在单次检测中同时评估样本量及样本质量，严防谨守助力深度测序；Roche DNA文库构建试剂盒 (KAPA HyperPrep Kit, KAPA HyperPlus Kit) 及RNA文库构建试剂盒 (KAPA RNA HyperPrep Kit) 等试剂盒具有操作极简 (一管到底)，建库快速 (单日内可完成)，文库质量和得率双高等优点；文库定量试剂盒 KAPA Library Quant Kit质量同监，为测序把好最后一道关；而mRNA-capture Kit、RNA-Seq with RiboErase和纯化磁珠对目标核酸分子的富集可有效降低测序成本。这些试剂盒可有效帮助用户获得稳定可靠的测序结果，为后期的科学实验验证及临床研究提供可信的数据依据。 (测序中国, 案例解析： 定向进化的KAPA酶，从困难样本获得高质量NGS数据的“灵魂”)

研究背景

甲状腺癌症的辅助检测方式包括B超检查， CT及MRI检查，血清甲状腺球蛋白浓度检等等。但均有其自身的局限性。如血清甲状腺球蛋白是组织特异性，非癌症特异性。而CT扫描会导致患者反复接触电离辐射，限制了它在临床上的应用。循环肿瘤DNA (ctDNA)已被证明是很多实体瘤中的生物标志物, 在甲状腺癌症中是否可以用血浆中的ctDNA作为肿瘤标志物，目前尚未有明确得结论。

生物材料：甲状腺癌组织样品 (FFPE 样品，H&E 染色样品切片及未染色切片)

实验目的

通过构建不同甲状腺癌病人的基因组文库，分析甲状腺癌变组织中基因发生突变的情况，以为ctDNA 是否能作为甲状腺癌标志物提供序列支持。

关键词： DNA，二代测序，甲状腺癌，ctDNA，cfDNA

实验步骤

1. 肿瘤组织DNA提取：使用Qiagen QIAamp DNA FFPE Kit进行肿瘤FFPE样本的DNA提取，并使用DNA Clean and Concentrator Kit (Zymo Research,CA,USA)。
2. 血液样本DNA提取：收集20ml血液样本，10min 1600g离心2次，取4ml血浆使用QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit试剂盒进行血浆样本DNA提取。
   
3. DNA文库构建：Qubit Fluorometer 检测DNA样品的浓度；【注：当DNA 浓度低于 5 ng/μl，使用试剂盒对DNA进行纯化及浓缩 (Zymo Research)】。取适量起始DNA进行文库构建：当DNA浓度 > 5 ng/μl，提取DNA的平均长度 > 1000 bp时，起始DNA为200 ng；当DNA浓度 > 5 ng/μl，提取DNA的平均长度 < 1000 bp时，起始DNA为400 ng；当其他情况时，起始DNA浓度为50 ng。起始浓度确定以后使用KAPA HyperPlus文库构建试剂盒进行文库构建，详细操作见KAPA HyperPlus使用手册。
4. 目标片段富集：根据已知的癌症突变热点设计探针，使用NimbleGen Capture hybridisation kit对目标区域进行富集。
5. 上机前质检：Taqman 定量PCR 进行上机前质检。
6. 测序及分析：阳性对照，阴性对照 (不含模板) 和待测样品混合后，在NextSeq 500或 MiSeq platform 测序平台上进行测序分析。
   

实验结果

本实验中，征集到52个甲状腺癌患者，51个患者癌组织样品用于后续的数据分析，根据切片51个患者可分为5个亚类：乳头状甲状腺癌，滤泡状甲状腺癌，弱分化甲状腺癌，未分化癌 (ATC)；甲状腺髓样癌 (MTC)。RNA-seq数据分析表明，在42个病例中，有58个基因发生了突变 (点突变或者小片段插入)，82%的以上的甲状腺癌病人中发生了基因突变 (见原文Fig 2)。 BRAF在乳头状甲状腺癌中发生的概率最高，NARS 和RET 分别在滤泡状及髓样癌中发生突变率最高 (见原文Fig 3)。

参考文献

1. Allin, D. M., Shaikh, R., Carter, P., Thway, K., Sharabiani, M. T. A., Gonzales-de-Castro, D., O'Leary, B., Garcia-Murillas, I., Bhide, S., Hubank, M., Harrington, K., Kim, D. and Newbold, K. (2018). Circulating tumour DNA is a potential biomarker for disease progression and response to targeted therapy in advanced thyroid cancer. Eur J Cancer 103: 165-175.
2. 罗氏诊断产品（上海）有限公司生命科学部. KAPA hyper plus 产品说明书.