实验名称: RNA-seq分析探寻涎腺管癌发生发展的分子机制和 生物学靶点以及与乳腺癌的相似程度
产品名称: KAPA Stranded RNA-Seq with RiboErase试剂盒Vendor   

[KAPA NGS产品在肿瘤研究中的应用] 下一代测序技术 (NGS)，又称为大规模平行测序技术，通常指第二代和第三代测序技术，与一代测序技术相比，其在测序速度以及成本上的优势使得该技术在肿瘤研究尤其是肿瘤诊断 (肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌) 及个体化用药治疗上的应用变为可能。
        构建高质量文库是运用NGS技术进行科学/临床研究的第一步也是非常关键的一步。进行肿瘤研究的文库类型主要有以下5种：全基因组测序 (WGS) (针对DNA)、全外显子组测序 (WES) (针对DNA)、全转录组测序 (针对RNA的RNA-seq)、 表观组测序 (甲基化及ChIP-seq)和靶向靶标测序 (DNA和RNA)。
        在科研及临床研究中，用于肿瘤相关研究的原始样品主要包括：FFPE样品、体液、单细胞、游离核酸等。从样品中分离出的用于文库构建的核酸起始样品量比较低 (通常1 ng 到几百ng 不等)，且核酸分子质量不高 (降解、损伤)。这些都对构建达到测序标准的高质量文库提出了挑战。
         Roche KAPA文库制备试剂为通过NGS进行肿瘤研究提供了整套解决方案 (Roche Dialog，罗氏诊断在华推广KAPA NGS新一代测序系列产品完善基因检测解决方案)。KAPA人类基因组DNA定量及QC试剂盒可以在单次检测中同时评估样本量及样本质量，严防谨守助力深度测序；Roche DNA文库构建试剂盒 (KAPA HyperPrep Kit, KAPA HyperPlus Kit) 及RNA文库构建试剂盒 (KAPA RNA HyperPrep Kit) 等试剂盒具有操作极简 (一管到底)，建库快速 (单日内可完成)，文库质量和得率双高等优点；文库定量试剂盒 KAPA Library Quant Kit质量同监，为测序把好最后一道关；而mRNA-capture Kit、RNA-Seq with RiboErase和纯化磁珠对目标核酸分子的富集可有效降低测序成本。这些试剂盒可有效帮助用户获得稳定可靠的测序结果，为后期的科学实验验证及临床研究提供可信的数据依据。 (测序中国, 案例解析： 定向进化的KAPA酶，从困难样本获得高质量NGS数据的“灵魂”)

研究背景

涎腺管癌是头颈部侵袭性最强的肿瘤之一，占涎腺癌的2%。大多数病例起源于腮腺或颌下腺，诊断时常已出现淋巴结转移和面神经麻痹。常规治疗方法包括手术切或辅助放疗，但局部疾病复发和远处转移较为常见，对化疗很少有反应，总体预后很差。并且，在目前研究中发现涎腺管癌和乳腺癌存在着共有的组织形态学特征，如大部分均具有雄激素受体 (AR) 的阳性染色。因此，本研究通过对16例涎腺管癌患者的肿瘤/正常组织的全基因组测序、肿瘤组织的转录组测序，来寻找涎腺管癌发生发展的分子机制和潜在的治疗靶点。并且与乳腺癌的数据进行比较分析，从分子层面证明了涎腺管癌和乳腺癌的相似性。

生物材料：涎腺管癌患者的肿瘤组织

实验目的

利用KAPA Stranded RNA-Seq with RiboErase试剂盒构建16例涎腺管癌患者肿瘤组织的转录组文库，分析得到其雄激素受体 (AR) 的表达以及剪切体的改变，可以作为对药物敏感性的一个指标。并且与TCGA上的乳腺癌数据进行比对，分析其相关性及亚型。

关键词：涎腺管癌，乳腺癌，雄激素受体，分子特征，RNA-seq

实验步骤

1. DNA和RNA提取：使用 RNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen) 试剂盒提取16例涎腺管癌患者的冻鲜样本组织和血液样本DNA;使用 RNeasy Mini Kit(Qiagen)试剂盒提取16例涎腺管癌患者的冻鲜样本组织和血液样本RNA。
2. DNA和RNA样品浓度质量检测：使用Thermo Fisher的PicoGreen assay和RiboGreen assay分别检测DNA与RNA的样品浓度；使用BioAnalyzer和Fragment Analyzer 检测RNA样品的质量。
3. RNA文库的构建：RNA文库构建操作使用的是KAPA Stranded RNA-Seq with RiboErase RNA 试剂盒,总RNA起始量为100 ng，经过去除核糖体RNA、打断、第一和第二链合成、加A尾、接头连接后，进行11个循环的PCR扩增成库。具体操作步骤参照KAPA Stranded RNA-Seq with RiboErase RNA 试剂盒说明书。
4. 文库定量：成库后使用KAPA Library Quantification试剂盒、Qubit荧光计 (Life Technologies) 和2100生物分析仪 (Agilent) 对最终文库进行定量。
5. 测序：在Illumina HiSeq2500 v4平台上进行测序分析，双端125bp。
6. 测序结果分析：将获得测序数据比对到人基因组上, 通过生物信息学分析基因融合情况。
   

实验结果

目前认为在涎腺管癌中雄激素受体 (AR) 存在剪切体的改变，通过分析RNS-seq数据分析发现，全长AR有8个外显子(1-8)，而剪切体AR-V7则是由AR外显子1-3和一个隐式外显子3 (CE3) 组成,并通过RT-PCR验证了这个结果 (见原文中Fig 2B-C)。以上结果表明在涎腺管癌中确实存在AR-V7这一可变的剪切体。
       既然涎腺管癌患者中存在着AR-V7阳性，那么在16例患者中存在的比例又如何呢？分析RNA-seq数据显示16例患者中有8例有AR-V7表达。与全长AR相比，AR-V7的比率在0.5%-15.1%之间。通过RT-PCR在8例患者中有7例证实了AR-V7的表达 (见原文中Fig 2C)。
       因都与AR受体相关，为了研究涎腺管癌和乳腺癌存在的关联。通过RNA-seq数据得到涎腺管癌患者基因的表达谱，并对两种肿瘤的PAM50基因的表达量聚类，尽管两类肿瘤起源于不同的器官，但它们并没有明显地聚为两类。相反，涎腺管癌与基底样和HER2富集的乳腺癌亚型聚集在一起，与管腔A/B和正常样乳腺癌亚型分开 (见原文中Fig 3A)。
       通过原文中Fig 3A结果，已发现涎腺管癌可以与不同类型的乳腺癌可以聚类在一起，那么涎腺管癌是否可以通过表达谱的不同，从而被分为不同的亚型。因此通过RNA-seq数据分析，得到AR和ERBB2基因表达 (FPKM)，可以根据AR和ERBB2基因的表达将16例涎腺管癌患者分为三组：AR和ERBB2基因均低表达的有4个；AR基因高表达、ERBB2基因低表达的有8个；AR和ERBB2基因均高表达的有4个 (见原文中Fig 3B)。
      提取原文Fig 3A中同时包含涎腺管癌和乳腺癌的第一组和第五组，并且结合原文中Fig 3B结果得到的三个涎腺管癌的亚型，发现4个AR和ERBB2基因均低表达的涎腺管癌亚型中有3个聚集在基底样乳腺癌中。并且不论ERBB2基因的表达如何，AR基因高表达的病例主要聚集在ERBB2基因高表达的乳腺癌中。这些发现表明，涎腺管癌不仅在组织学上与乳腺癌表现出明显的相似性，而且在总体基因表达模式上也表现出明显的相似性 (见原文Fig 3C)。

参考文献

1. Dalin, M. G., Desrichard, A., Katabi, N., Makarov, V., Walsh, L. A., Lee, K. W., Wang, Q., Armenia, J., West, L., Dogan, S., Wang, L., Ramaswami, D., Ho, A. L., Ganly, I., Solit, D. B., Berger, M. F., Schultz, N. D., Reis-Filho, J. S., Chan, T. A. and Morris, L. G. (2016). Comprehensive Molecular Characterization of Salivary Duct Carcinoma Reveals Actionable Targets and Similarity to Apocrine Breast Cancer. Clin Cancer Res 22(18): 4623-4633.
2. 罗氏诊断产品（上海）有限公司生命科学部. KAPA Stranded RNA-Seq with RiboErase试剂盒产品说明书.