[KAPA建库试剂盒在生殖遗传研究中的应用] 生殖遗传研究通常是以微量的样本进行的，二代测序特别是现有的单细胞技术为生殖发育提供了新的方向及便利，当前二代测序技术主要应用在：1) 产前诊断，可以通过无创产前采血，从孕妇血液中获取胎儿和母体混合物，在极微量的条件下对高风险及可能发生的遗传病进行检测。2) 胚胎发育的研究，单细胞测序的低样本量要求，可以对珍贵样本，如：受精卵，囊胚期、原肠胚期等早期胚胎进行精准分析，进一步绘制胚胎发育的各种图谱，完善对生殖发育的了解。KAPA NGS建库试剂盒采用KAPA HiFi酶及优化体系，其具有高保真性及超强扩增能力，适用的起始核酸量范围广，非常适用于微量样本文库的构建，同时保障高转化率与高文库得率为生殖遗传研究及临床诊断的准确性提供了保障(Roche Dialog，https://dialog.roche.com/cn/zh_cn/home.html)。
研究背景
疾病的表观跨代遗传和表型变异可以由毒物诱导，例如乙烯菌核利。表观跨代遗传包括种系中（例如精子）DNA甲基化，非编码RNA（ncRNA）和组蛋白保留和/或修饰。这些不同的表观遗传标记称为表观突变，可以部分传递跨代表型。而已有研究表明来自受伤雄性精子sncRNA注射到正常卵子后会影响后代的行为以及代谢，说明sncRNA会对早期生存环境因子非常敏感，在创伤诱导表型的跨代遗传中具有重要作用(Gapp et al., 2014)。前人的研究表明ncRNA参与调控基因表达过程，并通过影响DNA的甲基化来或与参与组蛋白修饰或染色质重构的蛋白互作来参与表观遗传控制。前人亦推测lncRNA 可能在维持表观遗传记忆中具有重要的作用，最近的研究也显示lncRNA的表达差异与DDT诱导的表观跨代遗传亦有相关关系。
生物材料：小鼠精子
实验目的
本研究中在小鼠雌性（F0代）怀孕胎儿性腺发育期，使其暴露于乙烯菌核利中。紧接着暴露F1，F2代，以及F3代精子。提取精子中的ncRNA，使用KAPA Stranded RNA-Seq Library Preparation kit with RiboErase建立rRNA去除的转录组，获取ncRNA数据，以分析比较不同乙烯菌核利诱导组与对照组精子中lncRNA及ncRNA的遗传情况。
关键词：RNA文库，二代测序，ncRNA，lncRNA，乙烯菌核利
实验步骤
- 样本来源：新鲜小鼠精子;
- RNA提取与质控：使用mirVana miRNA Isolation 试剂盒提取总RNA; 利用Agilent 2100 Bioanalyzer进行RNA质量把控，RIN值在2–4证明精子RNA质量良好；RNA浓度使用Qubit RNA HS Assay Kit进行定量分析。
- 总RNA文库构建：使用KAPA Stranded RNA-Seq Library Preparation kit with RiboErase试剂盒(货号)进行总RNA文库构建。具体操作参见产品说明书。建库中使用的接头可以选用Roche配套的单端SI、双端DI标记接头以及新上市的独特双端标记接头UDI（货号 SI:#08005770001,DI:#08278512001, UDI:#08861862001）。在进行文库扩增之前，还使用KAPA实时文库扩增试剂盒确定后续文库扩增循环数（货号：#07959028001），然后可以使用KAPA文库扩增试剂盒进行文库扩增（货号：#07958978001），并使用纯化磁珠进行片段筛选，选择获得300-700 bp片段，纯化磁珠也推荐Roche配套的KAPA Pure Beads（货号：#07983271001）。
- 测序：文库被汇集并加载到一个Illumina NextSeq High Output 1x75芯片，并在Illumina NextSeq 500平台上进行测序。使用生物信息学分析将mRNA文库与ncRNA文库分离。
实验结果
通过生信分析从药物处理的小鼠精子中分离中总非编码RNA(ncRNA) 后，利用合适的方法和条件，将sncRNA及lncRNA富集后分别建库进行分析，结果表明，尽管读段的深度不同（见原文中Fig 5A及 5B），不同代小鼠中sncRNA及lncRNA均存在明显差异，随着遗传代数的增加，lncRNA数量逐渐减低（F1>F2>F3）。sncRNA 可以分为piRNA、mirRNA、stRNA及其他类型的sncRNA。在F1及F3代中，piRNA表达量相对最高。而在F2代中stRNA表达量最高（见原文中Fig 5C及5D）。
F1，F2 及F3代间差异ncRNA及lnRNA 在各染色质上均有分布；而lncRNA的分析结果显示几代鼠之间的重叠表明绝大多数差异lncRNA在每一代中都是不同的 (见原文中Fig 6)。
遗传代间差异ncRNA中的sncRNA所在的染色体位置呈现于原文中Fig 7。结果揭示了大多数差异sncRNA对每一代都是独特的。不论是lnc还是sncRNA都是有代间差异的。
参考文献
- Ben Maamar, M., Sadler-Riggleman, I., Beck, D., McBirney, M., Nilsson, E., Klukovich, R., Xie, Y., Tang, C., Yan, W. and Skinner, M. K. (2018). Alterations in sperm DNA methylation, non-coding RNA expression, and histone retention mediate vinclozolin-induced epigenetic transgenerational inheritance of disease. Environ Epigenet 4(2): dvy010.
- Gapp, K., Jawaid, A., Sarkies, P., Bohacek, J., Pelczar, P., Prados, J., Farinelli, L., Miska, E. and Mansuy, I. M. (2014). Implication of sperm RNAs in transgenerational inheritance of the effects of early trauma in mice. Nat Neurosci 17(5): 667-669.
- 罗氏诊断产品（上海）有限公司生命科学部. KAPA Stranded RNA-Seq Library Preparation kit with RiboErase.