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适用说明:本文档为用于Illumina 平台的KAPA RNA HyperPrep 试剂盒提供了一份详细的实验方法。

友情提示:本文档包含原说明书中的产品描述,产品应用及实验操作流程、故障排查等主要信息,欲了解关于本产品详细说明及信息,建议参考原说明书 (点击面板上“下载PDF”可下载)。

产品描述


用于Illumina测序的KAPA RNA HyperPrep试剂盒,包含已纯化的1-100 ng的总RNA,或已去除核糖体RNA,或PolyA富集的RNA进行链特异性的RNA-Seq文库快速构建所需的所有缓冲液和酶,具体步骤如下:

  1. 采用加热和镁进行片段化;
  2. 采用随机引物结合进行第一条链cDNA合成;
  3. 结合第二条链合成和加A尾,将cDNA:RNA杂合体转化为双链cDNA(dscDNA),将dUTP掺入第二条cDNA链,进行链式RNA测序,并在所得dscDNA的3'末端加入dAMP;
  4. 接头连接,即在文库插入片段上连接带有3' dTMP端的dsDNA接头;以及
  5. 文库扩增,使用高保真低偏差PCR,扩增在两端携带适当接头序列的文库片段。标记有dUTP的链未被扩增,允许进行链特异性测序。

该试剂盒提供用于反应纯化的KAPA纯化磁珠,以及用于cDNA合成、文库构建和扩增所需的所有酶和缓冲液,但不包括RNA或接头。KAPA接头另售。

反应缓冲液以方便的形式提供了所有需要的反应组分。这最大限度地降低了RNA酶污染的风险,确保了反应组分的一致性和均质性,并改善了重复样本之间的均一性。同样,文库构建过程的每一个步骤都配有单独的酶混合物,从而减少了移液步骤的次数。

为了使序列覆盖均一性最大化,并维持相对的转录本丰度,尽量减少文库扩增偏差是至关重要的。KAPA HiFi DNA聚合酶是为低偏差高保真PCR而设计,是NGS文库扩增的首选聚合酶1, 2, 3, 4。KAPA RNA HyperPrep试剂盒包含用于文库扩增的KAPA HiFi 热启动高保真酶预混液(2X)和文库扩增引物混合物(10X)。

  1. Oyola, S.O., et al., BMC Genomics 13, 1 (2012).
  2. Quail, M.A., et al., Nature Methods 9, 10-11 (2012).
  3. Quail, M.A., et al., BMC Genomics 13, 341 (2012).
  4. Ross, M.G., et al., Genome Biology 14, R51 (2013).

产品应用

KAPA RNA HyperPrep试剂盒既可手动操作也可自动化操作,为已纯化的1-100ng总RNA,去除核糖体RNA,或polyA富集的RNA,构建高质量的文库。该实验方法适用于多种类型的RNA测序应用,包括:

● 靶向RNA测序;
● 全转录组;
● 高质量和低质量RNA样本(例如,从FFPE组织提取的样本)的基因表达分析;
● 单核苷酸多态性(SNV)发现;以及
● 剪切点和基因融合突变识别。

该试剂盒与长度< 100 bp的小RNA不兼容。

工作流程图

实验操作流程


  1. 试剂准备
    完成该实验方法耗时约4小时。理想情况下,应根据需要准备流程中不同步骤的预混液。

    为获得最高的稳定性和最长的保质期,KAPA RNA HyperPrep试剂盒中的酶和反应缓冲液分开提供。对于精简的实验方法,每一步酶促步骤都需要制备一份至少有10%多余量的试剂预混液,如表1-表5中所示。表5列出了KAPA RNA HyperPrep试剂盒实验方法中所需的其他试剂的量。

    需始终确保KAPA纯化磁珠和PEG/NaCl溶液在使用前已彻底平衡至室温。

    表1. 第一条链合成


    表2. 第二条链合成与加A尾


    表3. 接头连接


    表4. 文库扩增


    表5. 所需其他试剂的量


  2. RNA片段化和预备
    该实验方法是在10 µL不含RNA酶的水中,需要总体积为1 - 100 ng的总RNA,或已去除rRNA的或polyA富集的RNA。

    在片段化、预备和洗脱缓冲液(1X)中重悬起始RNA,并在高温下通过孵育将其片段化成所需片段大小。

    2.1
    按照如下方法在室温下制备所需量的片段化、预备和洗脱缓冲液(1X):


    2.2
    通过反复轻轻吹打进行彻底混匀。
    2.3
    将板/管置于热循环仪中,并按照如下方法进行片段化和预备程序:


    2.4
    将板/管置于冰上,立即继续进行第一条链合成(步骤3)。

  3. 第一条链合成
    3.1
    在冰上,按照如下所述组装第一条链合成反应:


    3.2
    将板/管保存在冰上,通过反复轻轻吹打进行彻底混匀。
    3.3
    采用如下实验方法孵育板/管:


    3.4
    将板/管置于冰上,立即继续进行第二条链合成与加A尾(步骤4)。

  4. 第二条合成与加A尾
    4.1
    在冰上,按照如下所述组装第二条链合成与加A尾反应:


    4.2
    将板/管置于冰上,通过反复轻轻吹打进行彻底混匀。
    4.3
    采用如下实验方法孵育板/管:


    4.4
    将板/管置于冰上,立即继续进行接头连接(步骤5)。

  5. 接头连接
    5.1
    稀释接头准备用于连接,目的是获得以下浓度:


    5.2
    在冰上,按照下述方式设置接头连接反应:


    5.3
    将板/管保存在冰上,通过反复轻轻吹打进行彻底混匀。
    5.4
    将板/管在20 °C下孵育15分钟。
    5.5
    立即进行第一次连接后纯化(步骤6)。

  6. 第一次连接后纯化
    6.1
    结合以下方法,进行一次0.63X基于磁珠的纯化:


    6.2
    通过涡旋振荡和/或反复轻轻吹打进行彻底混匀。
    6.3
    将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
    6.4
    将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠,孵育直至液体澄清。
    6.5
    小心吸出并丢弃175 μl的上清液。
    6.6
    将板/管保持在磁力架上,加入200 μl 80%乙醇。
    6.7
    在室温下将板/管在磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    6.8
    小心吸出并丢弃上清液。
    6.9
    将板/管保持在磁力架上,加入200 μl 80%乙醇。
    6.10
    在室温下将板/管在磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    6.11
    小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下,尝试去除所有残留的乙醇。
    6.12
    在室温下将磁珠干燥3-5分钟,或直至所有乙醇挥发。
    注意:过度干燥磁珠可能会导致收率降低。
    6.13
    从磁力架上取下板/管。
    6.14
    在50 μl 10mM的Tris-HCl(pH 8.0-8.5)中彻底重悬磁珠。
    6.15
    将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
    安全停止点:含有重悬磁珠的溶液可在2 °C至8 °C储存 ≤ 24小时。不要冰冻磁珠,因为这会导致DNA大量丢失。准备好后,进行第二次连接后纯化(步骤7)。

  7. 第二次连接后纯化
    7.1
    结合以下方法,进行一次0.7X基于磁珠的纯化:


    7.2
    通过涡旋振荡和/或反复轻轻吹打进行彻底混匀。
    7.3
    将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
    7.4
    将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    7.5
    小心吸出并丢弃80 μl的上清液。
    7.6
    将板/管置于磁力架上,加入200 μl 80%乙醇。
    7.7
    在室温下将板/管在磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    7.8
    小心吸出并丢弃上清液。
    7.9
    将板/管置于磁力架上,加入200 μl 80%乙醇。
    7.10
    在室温下将板/管在磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    7.11
    小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下,尝试去除所有残留的乙醇。
    注意:过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
    7.12
    在室温下将磁珠干燥3-5分钟,或直至所有乙醇挥发。
    7.13
    从磁力架上取下板/管。
    7.14
    在22 μl 10mM的Tris-HCl(pH 8.0-8.5)中彻底重悬磁珠。
    7.15
    将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
    7.16
    将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    7.17
    将20 μl澄清的上清液移液到新的平板/管中,并进行文库扩增(步骤8)。
    安全停止点:纯化的接头连接文库DNA可以在2 °C至8 °C下储存 ≤ 1周,或冰冻在-15 °C至-25 °C下储存 ≤ 1个月。准备好后,继续进行文库扩增(步骤8)。

  8. 文库扩增
    8.1
    按如下方式组装每个文库扩增反应:


    8.2
    通过反复轻轻吹打进行充分混合。
    8.3
    使用以下PCR循环条件扩增文库:

    *非标准(即除Illumina TruSeq外)接头/引物组合可能需要优化退火温度

    表6. 推荐的文库扩增循环


    8.4
    立即进行文库扩增纯化(步骤9)。

  9. 文库扩增纯化
    9.1
    结合以下方法,进行一次1X基于磁珠的纯化:


    9.2
    通过涡旋振荡和/或反复吹打进行彻底混匀。
    9.3
    将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
    9.4
    将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    9.5
    小心吸出并丢弃95 μl的上清液。
    9.6
    将板/管置于磁力架上,加入200 μl 80%乙醇。
    9.7
    在室温下将板/管在磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    9.8
    小心吸出并丢弃上清液。
    9.9
    将板/管置于磁力架上,加入200 μl 80%乙醇。
    9.10
    在室温下将板/管在磁力架上孵育 ≥ 30秒。
    9.11
    小心吸出并丢弃上清液。在不搅动磁珠的情况下,尝试去除所有残留的乙醇。
    9.12
    在室温下将磁珠干燥3-5分钟,或直至所有乙醇挥发。
    注意:过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
    9.13
    在22 μl 10 mM的Tris-HCl(pH 8.0-8.5)中彻底重悬已干燥的磁珠。
    9.14
    将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
    9.15
    将板/管放置在磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
    9.16
    将20 μl澄清的上清液转移到一个新的板/管中,并将纯化的扩增文库在2 °C至8 °C下储存 ≤ 1周,或在-15 °C至-25 °C下储存。

使用过本产品的部分文献

  1. Buzdin, A., Sorokin, M., Garazha, A., Sekacheva, M., Kim, E., Zhukov, N., Wang, Y., Li, X., Kar, S., Hartmann, C., Samii, A., Giese, A. and Borisov, N. (2018). Molecular pathway activation - New type of biomarkers for tumor morphology and personalized selection of target drugs. Semin Cancer Biol 53: 110-124.
  2. Conner, B. R., Hernandez, F., Souders, B., Landrith, T., Boland, C. R. and Karam, R. (2019). RNA analysis identifies pathogenic duplications in MSH2 in patients with lynch syndrome. Gastroenterology 156(6): 1924-1925 e1924.
  3. Guo, M., Price, M. J., Patterson, D. G., Barwick, B. G., Haines, R. R., Kania, A. K., Bradley, J. E., Randall, T. D., Boss, J. M. and Scharer, C. D. (2018). EZH2 Represses the B Cell transcriptional program and regulates antibody-secreting cell metabolism and antibody production. J Immunol 200(3): 1039-1052.
  4. Li, Y., Pan, W., Connolly, I. D., Reddy, S., Nagpal, S., Quake, S. and Gephart, M. H. (2016). Tumor DNA in cerebral spinal fluid reflects clinical course in a patient with melanoma leptomeningeal brain metastases. J Neurooncol 128(1): 93-100.
  5. Marggraf, M. B., Panteleev, P. V., Emelianova, A. A., Sorokin, M. I., Bolosov, I. A., Buzdin, A. A., Kuzmin, D. V. and Ovchinnikova, T. V. (2018). Cytotoxic potential of the novel horseshoe crab peptide polyphemusin III. Mar Drugs 16(12).
  6. Takai, E., Totoki, Y., Nakamura, H., Kato, M., Shibata, T. and Yachida, S. (2016). Clinical utility of circulating tumor DNA for molecular assessment and precision medicine in pancreatic cancer. Adv Exp Med Biol 924: 13-17.
  7. Thomsen, M. B. H., Nordentoft, I., Lamy, P., Vang, S., Reinert, L., Mapendano, C. K., Hoyer, S., Orntoft, T. F., Jensen, J. B. and Dyrskjot, L. (2017). Comprehensive multiregional analysis of molecular heterogeneity in bladder cancer. Sci Rep 7(1): 11702.
  8. Zhu, M., Jia, N., Nie, Y., Chen, J., Jiang, Y., Lv, T., Li, Y., Yao, L. and Feng, W. (2018). Establishment of patient-derived tumor xenograft models of high-risk endometrial cancer. Int J Gynecol Cancer 28(9): 1812-1820.
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
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