产品说明书：KAPA DNA HyperPrep文库构建   

友情提示：
1)本文档中的页码，附录均指原说明书中的页码及附录；
2)本文档包含原说明书中的产品描述，产品应用及实验操作流程、故障排查等主要信息，欲了解关于本产品详细说明及信息，建议参考原说明书 (点击面板上“下载PDF”可下载）。

产品描述

KAPA DNA HyperPrep文库构建试剂盒提供了一种灵活、操作简化的实验方法，用于从片段化的双链DNA（dsDNA）开始的快速构建Illumina测序文库。新型化学法和简化的单管工作流程提高了不同类型和起始量的DNA样本中进行文库构建的效率和一致性。

该工作流程结合了酶促步骤，并采用最少的基于磁珠的纯化，从而将样本处理和整个文库制备时间缩短至2-3小时。该试剂盒包含以下所需的所有酶和反应缓冲液：

1. 末端修复和加A尾，可产生末端经修复的，并5'-磷酸化、3'-dA加尾的dsDNA片段；
2. 接头连接，这期间具有3'-dTMP端的dsDNA接头与3'-dA加尾的分子连接；
3. 文库扩增（可选），采用高保真、低偏差PCR扩增两端携带适当接头序列的文库片段。

该试剂盒为两个文库构建步骤中的每一步提供单一的浓缩缓冲液和单一的酶的混合物。从而提供了最佳的产品稳定性、简易度和效率的组合。但不包括接头以及连接和文库扩增后纯化所需的磁珠。KAPA纯化磁珠和KAPA接头是单独出售的。

为了使序列的覆盖均一性最大化，将文库扩增偏差控制到最小是至关重要的。KAPA HiFi DNA聚合酶是专为低偏差、高保真度PCR设计的，也是NGS文库扩增的首选试剂^{1，2，3，4}。 KAPA DNA HyperPrep文库构建试剂盒包括KAPA HiFi热启动高保真酶预混液（2X），是一种随时可使用的包含了文库扩增所有组分的PCR混合物（不包括引物和模板）。试剂盒还包括了文库扩增混合引物（10X），是设计用于两侧含有P5和P7 Illumina流动槽序列的文库的高效扩增。没有扩增模块的试剂盒（KK8501、KK8503和KK8505）可用于无PCR扩增流程。它们还可以与KAPA HiFi实时文库扩增试剂盒（KK2701和KK2702）或KAPA HiFi Uracil+热启动高保真酶预混液（KK2801和KK2802）结合用于扩增亚硫酸氢盐转化的文库。

1. Oyola, S.O., et al., BMC Genomics 13, 1 (2012).
2. Quail, M.A., et al., Nature Methods 9, 10 (2012).
3. Quail, M.A., et al., BMC Genomics 13, 341 (2012).
4. Ross, M.G., et al., Genome Biology 14, R51 (2013).
   
   

产品应用

KAPA DNA HyperPrep文库构建试剂盒非常适用于低通量和高通量NGS文库构建工作流程，这些工作流程需要进行末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增（可选）。该试剂盒设计用于从各种类型和起始量（1 ng-1 μg）的DNA样本开始构建文库，兼容复杂的基因组DNA、细胞游离DNA/循环肿瘤DNA和低质量DNA（如FFPE）。对于小基因组、细胞游离DNA/循环肿瘤DNA和较低复杂性的样本（如ChIP DNA）、扩增子或cDNA（用于RNAseq），可以尝试低起始DNA（~100 pg或更多）进行文库构建。

该实验方法是自动化友好的，可以整合到一系列NGS应用的工作流程中，包括：

● 全基因组，鸟枪法测序
● 全外显子或靶向测序，使用Roche SeqCap EZ、Agilent SureSelect、Illumina TruSeq或IDT xGen Lockdown探针，或其他杂交捕获系统
● 染色质免疫共沉淀测序
● RNA-seq（从cDNA开始）
● 甲基化测序（结合KAPA HiFi Uracil+热启动高保真酶预混液进行文库扩增）。

工作流程图

实验操作流程

注意：该实验方法不包括片段选择。有关双侧片段选择实验方法的详细信息，请参阅原说明书附录1。

1. 末端修复和加A尾
   1.1

   如下所述，在PCR管或孔中配制每个末端修复和加A尾反应： 
   
   *最好将缓冲液和酶混合物进行预混合，并在单次移液步骤中加入。预混合物在室温下可保持 ≤ 24小时，在2 °C至8 °C下可保持 ≤ 3天，在-15 °C至-25 °C下可保持 ≤ 4周。
   
   
   1.2

   轻轻涡旋并瞬时离心沉降。将PCR板/管放回冰上。立即继续下一步。
   1.3

   在热循环仪中进行孵育，采用如下所述设置程序：
   
   *孵育时需要加热盖。如果可能，将盖子的温度设置为85 °C，而不是通常的~105 °C。
   **如果立即进行接头连接反应，可将反应冷却至20 °C而不是4 °C。
   
   
   1.4

   立即继续进行接头连接（步骤2）。

   
   
2. 接头连接
   2.1

   将接头原液稀释至适当的浓度，如下表：
   
   
   
   2.2

   在进行末端修复和加A尾的相同PCR板/管中，按如下方式配制每个接头连接反应：
   
   *将水、缓冲液和连接酶进行预混合，并在单次移液步骤中加入。预混合物在室温下可保持 ≤ 24小时，在4 °C下可保持 ≤ 3天，在-20 °C下可保持≤4周。
   
   
   2.3

   充分混合并瞬时离心。
   2.4

   在20 °C孵育15分钟。
   注意：如果要获得更高的转化率和文库产量，特别是对于低起始样本，可以考虑增加连接时间，增加至20 °C时最多4小时，或者在2 °C到8 °C下过夜。请注意，更长的连接时间可能导致接头二聚体产物增加。如果连接时间显著延长，则必须优化接头浓度。
   
   2.5

   立即继续下一步。
   
   
3. 连接后纯化
   
   3.1

   在相同的PCR板/管中，通过结合以下组分，进行0.8X基于磁珠的纯化。
   
   
   
   3.2

   通过涡旋和/或多次上下移液进行彻底混合。
   3.3

   将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
   3.4

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   3.5

   小心吸出并丢弃上清液。
   3.6

   将板/管置于磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
   3.7

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   3.8

   小心吸出并丢弃上清液。
   3.9

   将板/管置于磁力架上，加入200 μl 80%乙醇。
   3.10

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   3.11

   小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
   3.12

   在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
   注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
   3.13

   从磁力架上取下板/管。
   3.14

   彻底重悬磁珠：
   ● 若下一步是进行文库扩增（步骤4），则用25μl洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5），洗脱或
   ● 若下一步是进行双侧片段选择（附录1），则用55μl洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5）洗脱。
   3.15

   将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
   3.16

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   3.17

   将澄清的上清液转移到新的PCR板/管中：
   ● 继续进行文库扩增（步骤4），转移20 μl上清液，或
   ● 继续进行双侧片段选择（附录1），转移50 μl上清液。
   
   
4. 文库扩增
   注意：请参阅重要参数：文库扩增（原说明书第6-7页）和KAPA NGS文库制备技术指南，了解有关优化文库扩增的更多信息。
   
   4.1

   按如下方式配制每个文库扩增反应：
   
   *或其他合适的10X文库扩增引物混合物。文库扩增反应中每种引物的推荐终浓度为0.5-4 μM。另请参阅重要参数：文库扩增（原说明书第6页）。
   
   
   4.2

   充分混合并瞬时离心。
   4.3

   使用以下循环实验方法进行扩增。
   
   *非标准（即除外Illumina TruSeq）接头/引物组合可能需要优化退火温度。
   
   
   4.4

   直接进行扩增后纯化（步骤5）。
   
   
5. 扩增后纯化
   
   5.1

   通过结合以下组分，在文库扩增板/管中执行1X基于磁珠的纯化：
   
   
   
   5.2

   通过涡旋和/或多次上下移液进行彻底混合。
   5.3

   将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
   5.4

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   5.5

   小心吸出并丢弃上清液。
   5.6

   将板/管置于磁力架上，加入200μl 80%乙醇。
   5.7

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   5.8

   小心吸出并丢弃上清液。
   5.9

   将板/管置于磁力架上，加入200μl 80%乙醇。
   5.10

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   5.11

   小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
   5.12

   在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
   注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
   5.13

   从磁力架上取下板/管。
   5.14

   将磁珠彻底重悬于适当容量的洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5）或PCR级 水中。如果进行靶向捕获，始终使用PCR级水。
   注意：如果进行第二次扩增后纯化，或双侧片段选择（参阅原说明书附录1），需要将磁珠重悬于55 μl洗脱缓冲液中。
   
   5.15

   将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
   5.16

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   5.17

   将澄清的上清液转移到新的平板/管中，并根据需要进行片段选择（参阅原说明书附录1）、文库QC、靶向捕获或测序。将纯化的扩增文库在2 °C至8 °C储存1-2周，或在-15 °C至-25 °C储存。

使用过本产品的部分文献

1. Ferrer, M., Gosline, S. J. C., Stathis, M., Zhang, X., Guo, X., Guha, R., Ryman, D. A., Wallace, M. R., Kasch-Semenza, L., Hao, H., Ingersoll, R., Mohr, D., Thomas, C., Verma, S., Guinney, J. and Blakeley, J. O. (2018). Pharmacological and genomic profiling of neurofibromatosis type 1 plexiform neurofibroma-derived schwann cells. Sci Data 5: 180106.
2. Garrett, M., Sperry, J., Braas, D., Yan, W., Le, T. M., Mottahedeh, J., Ludwig, K., Eskin, A., Qin, Y., Levy, R., Breunig, J. J., Pajonk, F., Graeber, T. G., Radu, C. G., Christofk, H., Prins, R. M., Lai, A., Liau, L. M., Coppola, G. and Kornblum, H. I. (2018). Metabolic characterization of isocitrate dehydrogenase (IDH) mutant and IDH wildtype gliomaspheres uncovers cell type-specific vulnerabilities. Cancer Metab 6: 4.
3. Guo, M., Price, M. J., Patterson, D. G., Barwick, B. G., Haines, R. R., Kania, A. K., Bradley, J. E., Randall, T. D., Boss, J. M. and Scharer, C. D. (2018). EZH2 Represses the B Cell Transcriptional Program and Regulates Antibody-Secreting Cell Metabolism and Antibody Production. J Immunol 200(3): 1039-1052.
4. Jones, M. B., Highlander, S. K., Anderson, E. L., Li, W., Dayrit, M., Klitgord, N., Fabani, M. M., Seguritan, V., Green, J., Pride, D. T., Yooseph, S., Biggs, W., Nelson, K. E. and Venter, J. C. (2015). Library preparation methodology can influence genomic and functional predictions in human microbiome research. Proc Natl Acad Sci U S A 112(45): 14024-14029.
5. Symons, J., Chopra, A., Malatinkova, E., De Spiegelaere, W., Leary, S., Cooper, D., Abana, C. O., Rhodes, A., Rezaei, S. D., Vandekerckhove, L., Mallal, S., Lewin, S. R. and Cameron, P. U. (2017). HIV integration sites in latently infected cell lines: evidence of ongoing replication. Retrovirology 14(1): 2.
6. Takai, E., Totoki, Y., Nakamura, H., Kato, M., Shibata, T. and Yachida, S. (2016). Clinical utility of circulating tumor DNA for molecular assessment and precision medicine in pancreatic cancer. Adv Exp Med Biol 924: 13-17.
7. Thomsen, M. B. H., Nordentoft, I., Lamy, P., Vang, S., Reinert, L., Mapendano, C. K., Hoyer, S., Orntoft, T. F., Jensen, J. B. and Dyrskjot, L. (2017). Comprehensive multiregional analysis of molecular heterogeneity in bladder cancer. Sci Rep 7(1): 11702.