产品说明书：KAPA HiFi Uracil+ 热启动高保真酶预混液PCR试验盒   

产品描述

KAPA HiFi HotStart是一种新型B族DNA聚合酶，经过生物加工增加了对DNA的亲和力，无需借助辅助蛋白或DNA结合域。与野生型B族DNA聚合酶和聚合酶混合物相比，这种酶固有的高延伸能力，能显著改善产量、催化速度和灵敏度。当用于新一代测序（NGS）文库扩增时，KAPA HiFi 热启动高保真DNA聚合酶的产量高，扩增误差小，序列覆盖均一性极高。

校正DNA聚合酶的预读功能会检测模板链中的促诱变尿嘧啶残基，并防止进一步的链延伸，从而减少或完全抑制PCR扩增。在KAPA HiFi Uracil+ 热启动高保真DNA聚合酶中，这种尿嘧啶结合袋被灭活，使其可以扩增含尿嘧啶的DNA。该酶显示出了与未修饰的KAPA HiFi 热启动 DNA聚合酶相同的高产量、低GC偏差和覆盖均一性，使其在使用亚硫酸氢盐DNA转化的应用时特别有优势，此时通常会产生低浓度的AT含量高的DNA。

KAPA HiFi Uracil+ 热启动高保真DNA聚合酶具有5′→3′聚合酶和3′→5′外切核酸酶（校正）活性，但没有5′→3′外切核酸酶活性。强大的3′→5′核酸外切酶活性在DNA扩增过程中带来了极高的准确性。在第一个变性循环之前，采用一种专用的抗体使聚合酶失活，从而最大限度地减少了在反应设置和启动期间因非特异性引发事件产生的伪扩增产物，并提高总反应效率。

KAPA HiFi Uracil+ 热启动高保真酶预混液（2X）是一种可以直接使用的混合物，含有PCR所需的所有组分，但不包括引物和模板。ReadyMix含所有dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP），各0.2 mM，不含dUTP。

产品应用

亚硫酸氢盐转化的DNA的扩增
亚硫酸氢钠处理将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不会被转化。在随后的PCR扩增过程中，胸腺嘧啶替换尿嘧啶，使得可以通过测序将DNA甲基化精确到碱基对水平。KAPA HiFi Uracil+ 热启动高保真酶预混液能够提供高产量的亚硫酸氢盐转化的DNA，并可进行稳定扩增。

KAPA HiFi Uracil+ 热启动高保真酶预混液特别适用于NGS应用，对于亚硫酸氢盐转化的文库，能够减少扩增误差，且提高扩增效率。使用KAPA HiFi Uracil+ 热启动高保真酶预混液进行文库扩增，可显着改善覆盖深度均一性，并更加完整地覆盖参考序列。

扩增受损的DNA样本
胞嘧啶脱氨作用会在一段较长的时间内自行发生，温度升高时脱氨速度加快，并导致DNA和游离核苷酸中尿嘧啶的累积。当其他校正酶无效时，KAPA HiFi Uracil+ DNA聚合酶可以从含有尿嘧啶的受损DNA模板中进行高保真扩增。

采用UDG预防扩增子污染
KAPA HiFi Uracil+ DNA聚合酶在扩增过程中很容易掺入dUTP，因此可与尿嘧啶-DNA-糖基化酶（UDG）联合使用，以防止残留污染。需要在PCR中加入dUTP，以便在扩增前通过UDG的消化去除可能污染后续反应的扩增子。

第1节：亚硫酸氢盐转化的NGS文库扩增的实验方法

1. 文库扩增
   文库扩增引物混合液（10X）（KK2623）（另售）旨在消除或延迟使用KAPA HiFi Uracil+ 热启动高保真酶预混液（2X）进行文库扩增反应时的引物耗竭。引物混合物适合于扩增两侧含有P5和P7流动槽序列的所有Illumina文库。引物以10X的浓度提供（各20 μM），并如前所述配制。用户提供的引物混合物可与不完整或定制的接头配合使用。有关用户提供的文库扩增引物的配制指南，请访问sequencing.roche.com/support联系技术支持。
   1.1

   按如下方式配制每个文库扩增反应：
   
   *或其他合适的10X文库扩增引物混合物。文库扩增反应中每种引物的推荐终浓度为0.5-2 μM。
   
   
   1.2

   充分混合并短暂离心。
   1.3

   使用以下循环实验方法进行扩增：
   
   ¹非标准（即除外Illumina TruSeq^®）接头/引物组合可能需要对退火温度进行优化。
   ²最佳循环次数将取决于加入到每个富集PCR反应中经过接头连接、片段大小分离、纯化的文库DNA的体积和浓度。
   

   
   
   1.4

   直接进行扩增后纯化（步骤2）。
   
   
2. 扩增后纯化
   2.1

   通过结合以下组分，在文库扩增板/管中执行1X基于磁珠的纯化：
   
   
   
   2.2

   通过涡旋和/或多次上下移液进行彻底混合。
   2.3

   将板/管在室温下孵育5-15分钟以将DNA结合到磁珠上。
   2.4

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   2.5

   小心吸出并丢弃上清液。
   2.6

   将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
   2.7

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   2.8

   小心吸出并丢弃上清液。
   2.9

   将板/管置于磁力架上，加入200 μL 80%乙醇。
   2.10

   在室温下将板/管于磁力架上孵育 ≥ 30秒。
   2.11

   小心吸出并丢弃上清液。在不影响磁珠的情况下，尝试去除所有残留的乙醇。
   2.12

   在室温下将磁珠干燥3-5分钟，或直至所有乙醇挥发。
   注意：过度干燥磁珠可能会导致产量降低。
   2.13

   从磁力架上取下板/管。
   2.14

   将磁珠彻底重悬于适当体积的洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5）或PCR级水中。如果进行靶向捕获，始终使用PCR级水。
   2.15

   将板/管在室温下孵育2分钟以从磁珠上洗脱DNA。
   2.16

   将板/管置于磁力架上以捕获磁珠。孵育直至液体澄清。
   2.17

   将澄清的上清液转移到新的PCR板/管中。将纯化的扩增的文库在2 °C至8 °C储存1-2周，或在-15 °C至-25 °C储存。
   
   

第2节：标准PCR的实验方法
重要！KAPA HiFi Uracil+热启动高保真酶预混液包含一份经过生物加工的B族（校正）DNA聚合酶和独特配方的缓冲液，需要专门的反应条件。如果不遵守这些条件，则可能出现反应失败。有关更多信息，请参阅重要参数。

1. 制备PCR反应预混液
   1.1

   KAPA HiFi HotStart Uracil+ 反应必须在冰上进行，因为在室温下酶的高校正活性会导致引物快速降解。
   1.2

   需要确保所有试剂均已正确解冻并混合。
   1.3

   制备PCR反应预混液，包含适量的全部反应组分，这些组分可用于即将进行的所有或一部分反应。
   1.4

   根据下表计算每种组分所需的量：
   
   ¹反应体积可在10-50 μL的范围内调节。对于25 μL以外的体积，按比例稀释试剂。不推荐反应体积 > 50 μL。
   ²KAPA HiFi Uracil+热启动高保真酶预混液含有2.5 mM MgCl₂（1X）。可以单独再添加额外的MgCl₂，但可能没有必要。
   ³KAPA HiFi Uracil+ 热启动高保真酶预混液在专用的反应缓冲液中含有0.3 mM的每种dNTP（1X）和0.5 U的KAPA HiFi HotStart Uracil+ DNA聚合酶（每25 μL反应）。
   ⁴第一种方法是在每25 μL反应中，使用 < 100 ng基因组DNA（10-100 ng）和 < 1 ng不太复杂的DNA（0.1-1 ng）。
   

   
   
2. 配制各自的反应体系
   2.1

   将适量的PCR反应预混液、模板和引物转移到PCR板的各个PCR管或孔中。
   2.2

   盖上或密封各个反应，混合并短暂离心。
   
   
3. 运行PCR
   使用以下循环方案执行PCR：
   
   ¹对于大多数应用，在95 °C下预变性3分钟即已足够。对于GC含量高（> 70% GC含量）的靶标，需要在95 °C下预变性5分钟。
   ²KAPA HiFi Uracil+ 热启动高保真酶预混液的盐浓度比传统PCR预混合物更高，这会影响DNA变性。为确保复杂且GC含量高的靶标完全变性，在循环过程中使用98 °C的温度变性。
   ³除DNA变性外，高盐也会影响引物退火。特定引物组的最佳退火温度可能与常规PCR预混合物使用的退火温度不同（更高）。推荐使用退火温度梯度PCR，以确定KAPA HiFi Uracil+ 热启动高保真酶预混液需用的最佳退火温度。如果梯度PCR不可行，则首选在65 °C退火。
   ⁴可以使用两步循环方案，其中组合的退火/延伸温度在68-75 °C的范围内，且可用组合的退火/延伸时间为30秒/kb。
   ⁵对于 ≤ 1kb的靶标，每个循环使用15秒延伸，而对于较长的片段，或为了提高产量，可使用30-60秒/kb延伸。
   ⁶为获得最高的保真度，需使用 ≤ 25个循环。在模板浓度非常低或反应效率低导致产量低的情况下，可进行30-35个循环，以产生足够用于下游应用的产物。