产品说明书：KAPA HiFi热启动高保真酶预混液PCR试剂盒Vendor   

友情提示：本文档包含原说明书中的产品描述，产品应用及实验操作流程、故障排查等主要信息，欲了解关于本产品详细说明及信息，建议参考原说明书 (点击面板上“下载PDF”可下载）。

产品描述

KAPA HiFi热启动高保真DNA聚合酶是一种新型B族DNA聚合酶，经过生物加工增加了对DNA的亲和力，无需借助辅助蛋白或DNA结合域。与野生型B族DNA聚合酶相比，这种酶固有的高延伸能力，能显著提高产量、催化速度和灵敏度。此外，还能显著改善扩增长片段以及富含GC和AG片段的能力。这种酶与专用抗体结合，能够抑制酶活直至第一次变性步骤。从而可防止在反应体系配制期间发生非特异性扩增，还能提高灵敏度，并改善反应效率。

在高保真酶预混液PCR试剂盒中，KAPA HiFi热启动高保真DNA聚合酶以方便的2X预混液形式提供，其中包含了除引物和模板之外的所有反应组分。每份1X浓度的ReadyMix反应体系中含有0.3 mM dNTPs、2.5 mM MgCl₂、0.5U KAPA HiFi热启动高保真DNA聚合酶（每25 μL反应含0.5 U）和稳定剂。

KAPA HiFi 热启动高保真酶预混液专为不同类型片段大小的靶标的常规高保真PCR 而设计。其错误率比野生型Taq DNA聚合酶低约100倍，但成功率和产量高于野生型B族（校正）DNA聚合酶。此外，KAPA HiFi HotStart明显比野生型B族DNA聚合酶需要的反应时间更短。

KAPA HiFi热启动高保真DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶和3'→5'外切核酸（校正）的活性，但没有5'→3'外切核酸酶活性。强大的3'→5'外切核酸酶活性在DNA扩增过程中提供了极高的准确性，使得KAPA HiFi热启动高保真DNA聚合酶在所有B族DNA聚合酶中发表的错误率最低（每加入3.6 x 10⁶个核苷酸发生1个错误）。这种保真度比野生型Taq DNA聚合酶高约100倍，也比其他B族DNA聚合酶和聚合酶混合物的保真度更高，可高达10倍。

使用KAPA HiFi热启动高保真酶预混液生成的DNA片段可用于常规下游分析和应用，包括限制酶消化、克隆和测序。使用KAPA HiFi热启动高保真酶预混液生成的PCR产物是平末端的，但可以加3'-dA尾，用于TA克隆。

产品应用

KAPA HiFi HotStart PCR试剂盒适用于：

● 常规测序的PCR（直接测序或克隆PCR产物的测序）
● 新一代测序文库扩增（与KAPA文库扩增实验方法结合使用时）
● 扩增DNA片段用于克隆和蛋白质表达或基因组表征
● 定点突变

有关这些应用和其他高保真PCR应用的更多信息，请参阅www.sequencing.roche.com上有关定点突变、常规高保真度PCR和高GC区域的高保真度PCR的KAPA HiFi应用说明。

实验操作流程

重要！KAPA HiFi热启动高保真酶预混液包含一份经过生物加工的B族（校正）DNA聚合酶和独特配方的缓冲液，需要专门的反应条件。如果不遵守这些条件，则可能出现反应失败。有关更多信息，请参阅重要参数。

1. 制备PCR反应预混液
   ● KAPA HiFi HotStart反应必须在冰上进行配制，因为在室温下酶的高校正活性会导致引物快速降解。
   ● 需要确保所有试剂均已正确解冻并混合。
   ● 制备适量的PCR反应预混液，其中包含了后续反应所需的通用组分。
   ● 根据下表计算每种组分所需的量：
   
   ¹反应体积可在10-50 μL的范围内调节。当体积超过25 μL，按比例稀释试剂。不推荐反应体积 > 50 μL。
   ²当用于下一代测序文库扩增时，请使用KAPA文库扩增试剂盒提供的说明书。
   ³KAPA HiFi热启动高保真酶预混液含有2.5 mM MgCl₂（1X）。可以单独再添加额外的MgCl₂，但通常没有必要。
   ⁴在专用的反应缓冲液KAPA HiFi热启动高保真酶预混液中：各dNTP浓度为0.3 mM（1X）; KAPA HiFi热启动高保真DNA聚合酶（每25 μL反应）0.5 U。
   ⁵第一种方法是在每25 μL反应中，使用 < 100 ng基因组DNA（10-100 ng）和 < 1 ng不太复杂的DNA（0.1-1 ng）。
   
   
   
2.  配制各自的反应体系
   ● 将适量的PCR反应预混液、模板和引物转移到PCR板的各个PCR管或孔中。
   ● 盖上或密封各个反应，混合并短暂离心。
   
   
3. 运行PCR
   ● 使用以下PCR循环条件¹进行扩增：
   
   ¹当用于二代测序文库扩增时，请使用KAPA文库扩增试剂盒提供的说明书。
   ²对于大多数应用，在95 °C下预变性3分钟即已足够。对于GC含量高（> 70% GC含量）的靶标，需要在95 °C下预变性5分钟。
   ³KAPA HiFi热启动高保真酶预混液的盐浓度比传统PCR预混合物更高，这会影响DNA变性。为确保复杂且GC含量高的靶标完全变性，在循环过程中使用98 °C的温度变性。
   ⁴除DNA变性外，高盐也会影响引物退火。特定引物组的最佳退火温度可能与常规PCR预混合物使用的退火温度不同（更高）。推荐使用退火温度梯度PCR，以确定KAPA HiFi热启动高保真酶预混液所需的最佳退火温度。如果梯度PCR不可行，则首选在65 °C退火。
   ⁵可以使用两步扩增法，其中退火/延伸温度在68-75 °C的范围内，退火/延伸时间为30 秒/kb。
   ⁶对于 ≤ 1kb的靶标，每个循环使用15 秒延伸，而对于较长的片段，或为了提高产量，可使用30-60 秒/kb延伸。
   ⁷为获得最高的保真度，需使用 ≤ 25个循环。在模板浓度非常低或反应效率低导致产量低的情况下，可进行30-35个循环，以产生足够用于下游应用的产物。

故障排除

使用过本产品的部分文献

1. Alkorta-Aranburu, G., Carmody, D., Cheng, Y. W., Nelakuditi, V., Ma, L., Dickens, J. T., Das, S., Greeley, S. A. W. and Del Gaudio, D. (2014). Phenotypic heterogeneity in monogenic diabetes: the clinical and diagnostic utility of a gene panel-based next-generation sequencing approach. Mol Genet Metab 113(4): 315-320.
2. Kitzman, J. O., Starita, L. M., Lo, R. S., Fields, S. and Shendure, J. (2015). Massively parallel single-amino-acid mutagenesis. Nat Methods 12(3): 203-206, 204 p following 206.
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4. Roy, B., Neumann, R. S., Snir, O., Iversen, R., Sandve, G. K., Lundin, K. E. A. and Sollid, L. M. (2017). High-throughput single-cell analysis of B cell receptor usage among autoantigen-specific plasma cells in celiac disease. J Immunol 199(2): 782-791.
5. Sjostrom, A. E., Sandblad, L., Uhlin, B. E. and Wai, S. N. (2015). Membrane vesicle-mediated release of bacterial RNA. Sci Rep 5: 15329.
6. Smallwood, S. A., Lee, H. J., Angermueller, C., Krueger, F., Saadeh, H., Peat, J., Andrews, S. R., Stegle, O., Reik, W. and Kelsey, G. (2014). Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity. Nat Methods 11(8): 817-820.
7. Wu, X., Zhang, H., Chen, J., Shang, S., Wei, Q., Yan, J. and Tu, X. (2016). Comparison of the fecal microbiota of dholes high-throughput Illumina sequencing of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene. Appl Microbiol Biotechnol 100(8): 3577-3586.
8. Yamamoto, S., Masuda, R., Sato, Y., Sado, T., Araki, H., Kondoh, M., Minamoto, T. and Miya, M. (2017). Environmental DNA metabarcoding reveals local fish communities in a species-rich coastal sea. Sci Rep 7: 40368.