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适用说明:
本文档适用于货号为 KK2600(07958919001), KK2601(07958927001)及 KK2602 (07958935001)产品。

友情提示:本文档包含原说明书中的产品描述,产品应用及实验操作流程、故障排查等主要信息,欲了解关于本产品详细说明及信息,建议参考原说明书 (点击面板上“下载PDF”可下载)。

产品描述

KAPA HiFi热启动高保真DNA聚合酶是一种新型B族DNA聚合酶,经过生物加工增加了对DNA的亲和力,无需借助辅助蛋白或DNA结合域。与野生型B族DNA聚合酶相比,这种酶固有的高延伸能力,能显著提高产量、催化速度和灵敏度。此外,还能显著改善扩增长片段以及富含GC和AG片段的能力。这种酶与专用抗体结合,能够抑制酶活直至第一次变性步骤。从而可防止在反应体系配制期间发生非特异性扩增,还能提高灵敏度,并改善反应效率。

在高保真酶预混液PCR试剂盒中,KAPA HiFi热启动高保真DNA聚合酶以方便的2X预混液形式提供,其中包含了除引物和模板之外的所有反应组分。每份1X浓度的ReadyMix反应体系中含有0.3 mM dNTPs、2.5 mM MgCl2、0.5U KAPA HiFi热启动高保真DNA聚合酶(每25 μL反应含0.5 U)和稳定剂。

KAPA HiFi 热启动高保真酶预混液专为不同类型片段大小的靶标的常规高保真PCR 而设计。其错误率比野生型Taq DNA聚合酶低约100倍,但成功率和产量高于野生型B族(校正)DNA聚合酶。此外,KAPA HiFi HotStart明显比野生型B族DNA聚合酶需要的反应时间更短。

KAPA HiFi热启动高保真DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶和3'→5'外切核酸(校正)的活性,但没有5'→3'外切核酸酶活性。强大的3'→5'外切核酸酶活性在DNA扩增过程中提供了极高的准确性,使得KAPA HiFi热启动高保真DNA聚合酶在所有B族DNA聚合酶中发表的错误率最低(每加入3.6 x 106个核苷酸发生1个错误)。这种保真度比野生型Taq DNA聚合酶高约100倍,也比其他B族DNA聚合酶和聚合酶混合物的保真度更高,可高达10倍。

使用KAPA HiFi热启动高保真酶预混液生成的DNA片段可用于常规下游分析和应用,包括限制酶消化、克隆和测序。使用KAPA HiFi热启动高保真酶预混液生成的PCR产物是平末端的,但可以加3'-dA尾,用于TA克隆。

产品应用

KAPA HiFi HotStart PCR试剂盒适用于:

● 常规测序的PCR(直接测序或克隆PCR产物的测序)
● 新一代测序文库扩增(与KAPA文库扩增实验方法结合使用时)
● 扩增DNA片段用于克隆和蛋白质表达或基因组表征
● 定点突变

有关这些应用和其他高保真PCR应用的更多信息,请参阅www.sequencing.roche.com上有关定点突变、常规高保真度PCR和高GC区域的高保真度PCR的KAPA HiFi应用说明。

实验操作流程

重要!KAPA HiFi热启动高保真酶预混液包含一份经过生物加工的B族(校正)DNA聚合酶和独特配方的缓冲液,需要专门的反应条件。如果不遵守这些条件,则可能出现反应失败。有关更多信息,请参阅重要参数。

  1. 制备PCR反应预混液
    ● KAPA HiFi HotStart反应必须在冰上进行配制,因为在室温下酶的高校正活性会导致引物快速降解。
    ● 需要确保所有试剂均已正确解冻并混合。
    ● 制备适量的PCR反应预混液,其中包含了后续反应所需的通用组分。
    ● 根据下表计算每种组分所需的量:

    1反应体积可在10-50 μL的范围内调节。当体积超过25 μL,按比例稀释试剂。不推荐反应体积 > 50 μL。
    2当用于下一代测序文库扩增时,请使用KAPA文库扩增试剂盒提供的说明书。
    3KAPA HiFi热启动高保真酶预混液含有2.5 mM MgCl2(1X)。可以单独再添加额外的MgCl2,但通常没有必要。
    4在专用的反应缓冲液KAPA HiFi热启动高保真酶预混液中:各dNTP浓度为0.3 mM(1X); KAPA HiFi热启动高保真DNA聚合酶(每25 μL反应)0.5 U。
    5第一种方法是在每25 μL反应中,使用 < 100 ng基因组DNA(10-100 ng)和 < 1 ng不太复杂的DNA(0.1-1 ng)。

  2.  配制各自的反应体系
    ● 将适量的PCR反应预混液、模板和引物转移到PCR板的各个PCR管或孔中。
    ● 盖上或密封各个反应,混合并短暂离心。

  3. 运行PCR
    ● 使用以下PCR循环条件1进行扩增:

    1当用于二代测序文库扩增时,请使用KAPA文库扩增试剂盒提供的说明书。
    2对于大多数应用,在95 °C下预变性3分钟即已足够。对于GC含量高(> 70% GC含量)的靶标,需要在95 °C下预变性5分钟。
    3KAPA HiFi热启动高保真酶预混液的盐浓度比传统PCR预混合物更高,这会影响DNA变性。为确保复杂且GC含量高的靶标完全变性,在循环过程中使用98 °C的温度变性。
    4除DNA变性外,高盐也会影响引物退火。特定引物组的最佳退火温度可能与常规PCR预混合物使用的退火温度不同(更高)。推荐使用退火温度梯度PCR,以确定KAPA HiFi热启动高保真酶预混液所需的最佳退火温度。如果梯度PCR不可行,则首选在65 °C退火。
    5可以使用两步扩增法,其中退火/延伸温度在68-75 °C的范围内,退火/延伸时间为30 秒/kb。
    6对于 ≤ 1kb的靶标,每个循环使用15 秒延伸,而对于较长的片段,或为了提高产量,可使用30-60 秒/kb延伸。
    7为获得最高的保真度,需使用 ≤ 25个循环。在模板浓度非常低或反应效率低导致产量低的情况下,可进行30-35个循环,以产生足够用于下游应用的产物。

故障排除


    使用过本产品的部分文献

    1. Alkorta-Aranburu, G., Carmody, D., Cheng, Y. W., Nelakuditi, V., Ma, L., Dickens, J. T., Das, S., Greeley, S. A. W. and Del Gaudio, D. (2014). Phenotypic heterogeneity in monogenic diabetes: the clinical and diagnostic utility of a gene panel-based next-generation sequencing approach. Mol Genet Metab 113(4): 315-320.
    2. Kitzman, J. O., Starita, L. M., Lo, R. S., Fields, S. and Shendure, J. (2015). Massively parallel single-amino-acid mutagenesis. Nat Methods 12(3): 203-206, 204 p following 206.
    3. Picelli, S., Bjorklund, A. K., Faridani, O. R., Sagasser, S., Winberg, G. and Sandberg, R. (2013). Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods 10(11): 1096-1098.
    4. Roy, B., Neumann, R. S., Snir, O., Iversen, R., Sandve, G. K., Lundin, K. E. A. and Sollid, L. M. (2017). High-throughput single-cell analysis of B cell receptor usage among autoantigen-specific plasma cells in celiac disease. J Immunol 199(2): 782-791.
    5. Sjostrom, A. E., Sandblad, L., Uhlin, B. E. and Wai, S. N. (2015). Membrane vesicle-mediated release of bacterial RNA. Sci Rep 5: 15329.
    6. Smallwood, S. A., Lee, H. J., Angermueller, C., Krueger, F., Saadeh, H., Peat, J., Andrews, S. R., Stegle, O., Reik, W. and Kelsey, G. (2014). Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity. Nat Methods 11(8): 817-820.
    7. Wu, X., Zhang, H., Chen, J., Shang, S., Wei, Q., Yan, J. and Tu, X. (2016). Comparison of the fecal microbiota of dholes high-throughput Illumina sequencing of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene. Appl Microbiol Biotechnol 100(8): 3577-3586.
    8. Yamamoto, S., Masuda, R., Sato, Y., Sado, T., Araki, H., Kondoh, M., Minamoto, T. and Miya, M. (2017). Environmental DNA metabarcoding reveals local fish communities in a species-rich coastal sea. Sci Rep 7: 40368.
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
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