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海洋微生物中DNA含量的流式检测   

钟春莲钟春莲*卢余盛卢余盛*贾力贾力 陈建明陈建明  (*contributed equally to this work)
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摘要:海洋微生物是海洋生物重要组成部分,因其多样性增加了海洋微生物DNA检测的难度。我们采用流式细胞术 (Flow cytomertry method, FCM),利用碘化丙啶 (Propidium iodide,PI) 荧光染料与细胞内DNA碱基的结合,可对海洋微生物DNA含量进行快速、准确的检测。

关键词: 海洋微生物, 流式细胞术, DNA含量

材料与试剂

  1. 70 μm细胞过滤器 (Beyogold, catalog number: FSTR040)
  2. 流式管 (BD Falcon, catalog number: BD 352054)
  3. 蛋白酶K (Solarbio, catalog number: P9460)
  4. 碘化丙啶 (Signalway Antibody LLC, SAB, catalog number: CA001)
  5. PBS (pH = 7.2~7.4, Solarbio, catalog number: P1020)
  6. 柠檬酸钠 (上海国药,catalog number: 241245)
  7. Triton X-100 (Solarbio, catalog number: T8200-100ml)
  8. 50% 的戊二醛溶液 (Sangon Biotech, catalog number: A500484)
  9. PI (Solarbio, catalog number: P8080)
  10. PI溶液 (见溶液配方)
  11. 1% 柠檬酸钠 (见溶液配方)
  12. 0.1% Triton X-100的PI溶液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 流式细胞仪 (美国BD公司,model: FACSAriaIII)
  2. 低速离心机 (中科中佳科学仪器公司,model: LX-200)
  3. 小型低温高速离心机 (德国Eppendorf公司,model: 5424R)
  4. -80 °C冰箱 (中国海尔集团,model: DW-86L388)
  5. 移液器 (德国Eppendorf公司)

实验步骤

  1. 在福建附近海域,依据采水标准层次采取50~200 ml水样。采水器上的采样瓶、采样袋及实验室内样品处理过程均需无菌操作 (Gregori等,2001)。
  2. 样品预处理:水样经70 μm滤膜进行预过滤,去除杂质,以免堵塞流式细胞仪。水样中加入浓度为50% 的戊二醛,使其终浓度达到0.5%,蛋白酶 K,使其终浓度达到20 g/L,轻轻混匀,避光固定15~20 min (杨等,2017)。如果样本不能在采集12小时内完成检测,可用移液器转移已固定好的水样于冻存管内4 °C保存,一个月内完成流式检测。若需长期保存,需将固定好的水样放于液氮中快速冷冻,最后放置于-80 °C冰箱中保存直至分析。
  3. 样品准备:若为-80 °C冰箱保存的水样,需将其放入4 °C冰箱解冻。
  4. 将已准备好的水样于12,000 x g 室温离心10 min,小心去除上清,收集沉淀 (沉淀即为水样中的微生物),若无明显沉淀可留取离心管底部液体用于后续实验 (Alapat,2018)。
  5. 用2 ml PBS将微生物沉淀重悬,清洗,12,000 x g 室温离心5 min,小心去除上清,收集微生物沉淀,此步骤重复2~3次。若无明显沉淀,只需用PBS清洗1次。
  6. 用200 μl PBS重悬步骤5中的微生物沉淀,加入1 μl PI 染料,混匀,室温避光染色10 min (Wu 等,2018; Zhang 等,2018)。
  7. 加入2 ml PBS重悬,12,000 x g 室温离心10 min,小心吸弃上清,收集微生物沉淀。
  8. 重复步骤7,将多余的PI染料去除,预留200 μl溶液上机检测。
  9. 在流式细胞仪上,先用未染色的微生物悬液设置检测参数,调节检测电压和阴性区域。
  10. 上机检测至少获取1 × 105 的阳性细胞做后续数据分析。

结果与分析

Correia等研究发现过氧化氢可以明显阻滞白色念球菌的细胞周期,其DNA含量呈现差异表达。如图1所示,横坐标表示DNA含量,通过PI的荧光强度显示,荧光越强,DNA含量越高;纵坐标表示细胞的数目。不同的峰代表处于不同的细胞周期,DNA含量处于2n~4n。红色代表正常培养状态下每隔15 min检测的白色念球菌DNA含量,灰色代表经1 mM H2O2处理不同时间检测白色念球菌DNA含量 (Correia等,2016)。若没有看到明显的特征峰,则表示实验失败,可能由于细胞破膜不充分,PI没有和细胞内DNA充分结合而导致实验失败。


图1. 过氧化氢阻滞白色念珠菌细胞周期于G1期. 白色念球菌在正常的培养条件和含1 mM H2O2的培养液中培养,每隔15 min收集菌液,经0.5% 戊二醛固定,PI染色,流式检测其DAN含量。红色代表白色念球菌在正常培养条件下DNA含量,灰色代表经H2O2处理后白色念球菌DNA含量 (Correia等,2016)。

溶液配方

  1. PI溶液
    用1 ml含有1% 柠檬酸钠的无菌水将10 mg PI粉末溶解,配置成浓度为10 mg/ml的储存液,-20 °C冰箱避光保存。使用时将储存液稀释200倍 (终浓度为50 μg/ml),加入Triton X-100,使其终浓度达到0.1%
  2. 1% 柠檬酸钠
    称取0.1 g柠檬酸钠溶于1 ml无菌水中
  3. 0.1% Triton X-100的PI溶液
    用移液器缓慢的吸取10 μl Triton X-100加入

致谢

本工作的顺利开展得益于国家自然科学基金项目 (资助号:81703555,81773063,U1505225和81273548)、国家重点基础研究发展计划 (973计划) 项目 (资助号:2015CB931804)、中国大洋专项课题 (资助号:DY135-2-13)、福建省科技厅平台项目 (资助号:2018N2001)、教育厅平台项目和中国博士后科学基金 (资助号:2017M620268)的经费支持。

参考文献

  1. 杨莉婷,何丽,何海宁,吴琼. (2017). 流式细胞术对生乳中微生物检测的应用研究. 广西师范大学学报, 2: 112-116.
  2. Alapat, D. (2018). Cytoplasmic immunoglobulin vs. DNA analysis by flow cytometry. Methods Mol Biol 1792: 35-45.
  3. Correia, I., Alonso-Monge, R. and Pla, J. (2016). The Hog1 map kinase promotes the recovery from cell cycle arrest induced by hydrogen peroxide in Candida albicans. Front Microbiol 7: 2133.
  4. Gregori, G., Citterio, S., Ghiani, A., Labra, M., Sgorbati, S., Brown, S. and Denis, M. (2001). Resolution of viable and membrane-compromised bacteria in freshwater and marine waters based on analytical flow cytometry and nucleic acid double staining. Appl Environ Microbiol 67(10): 4662-4670.
  5. Naganowska, B., Wolko, B., Sliwinska, E. and Kaczmarek, Z. (2003). Nuclear DNA content variation and species relationships in the genus Lupinus (Fabaceae). Ann Bot 92(3): 349-355.
  6. Wu, D., Liang, M., Dang, H., Fang, F., Xu, F. and Liu, C. (2018). Hydrogen protects against hyperoxia-induced apoptosis in type II alveolar epithelial cells via activation of PI3K/Akt/Foxo3a signaling pathway. Biochem Biophys Res Commun 495(2): 1620-1627. 
  7. Zhang, N., Fan, Y., Li, C., Wang, Q., Leksawasdi, N., Li, F. and Wang, S. (2018). Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Appl Microbiol Biotechnol 102(9): 4183-4191.
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Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:钟春莲, 卢余盛, 贾力, 陈建明. (2019). 海洋微生物中DNA含量的流式检测. Bio-101: e1010348. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010348.
How to cite: Zhong, C. L., Lu, Y. S., Jia, L. and Chen, J. M. (2019). DNA Content Analysis in Marine Microorganisms by Flow Cytometry. Bio-101: e1010348. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010348.
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