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B细胞抗体类别的流式检测   

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摘要:B 细胞主要通过呈递抗原和产生抗体在自身免疫病的发生、发展中发挥重要作用,每个B细胞开始时一般均表达IgM,但随后可通过抗体类别转换表达和产生IgG, IgA或IgE,B细胞针对每个抗原产生的抗体类别不同,且不同类别的抗体功能也不同,于是我们利用检测抗原特异性B细胞免疫反应后的抗体类别,对其表达和功能进行分析。由于流式细胞仪是使细胞以单个方式依次通过探测光束,并采集细胞被光照时产生的各种信号,并能对多个荧光参数进行关联分析的一种仪器,所以我们对富集后的抗原特异性B细胞抗体类别通过流式细胞仪进行检测。

关键词: B细胞, 流式细胞染色, 流式细胞仪

材料与试剂

  1. 5 ml 流式管
  2. 枪尖若干:2 µl、20 µl、100 µl、200 µl 和 1 ml
  3. 40 μm和70 μm过滤筛
  4. U型底96孔板
  5. 六孔板
  6. 15 ml、50 ml离心管
  7. 1 ml带针注射器
  8. 解剖工具和烧杯
  9. 可放置5 ml流式管的试管架 2~3 个
  10. Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 MicroBeads (Miltenyi, catalog number: 130-091-395)
  11. LS Separation columns (Miltenyi, catalog number: 130-042-401)
  12. 小鼠 (C57BL/6小鼠,雌雄不限,8周以上,数量根据实验需求安排)
  13. 大鼠血清
  14. Anti-CD16/32抗体
  15. DNase I 10 mg/ml (Worthington,catalog number: LS002140,溶剂为20 mM Tris,1 mM MgCl2,PH 7.5)
  16. Collagenase 4,000 U/mg (Worthington,catalog number: LS004177,溶剂为PBS)
  17. Qb-AF647 (荧光蛋白) (Qb为实验室自行表达纯化,用AF647标记试剂盒 (Invitrogen, catalog number: A20173) 标记Qb,合成Qb-AF647)
  18. FCS
  19. 流式抗体 (表1)

    表1. 流式抗体详细信息


  20. PBS 溶液和蒸馏水 (0.22 µm 滤膜过滤)
  21. RPMI-1640 (HyClone, catalog number: SH30809.01)
  22. HEPES (25 mM, PH 7.4) (Sigma-Aldrich, catalog number: H3375,溶剂为ddH2O)
  23. EDTA·2H2O
  24. NaN3
  25. Tris
  26. MgCl2
  27. NaOH
  28. BD Cytofix/Cytoperm缓冲液
  29. BD 1 x Cytoperm/Wash缓冲液
  30. 消化液 (见溶液配方)
  31. FC block (见溶液配方)
  32. FACS缓冲液 (见溶液配方)
  33. 0.5 M EDTA (见溶液配方)

仪器设备

  1. 10 µl、200 µl、1,000 µl移液枪
  2. 12通道200 µl排枪
  3. 磁力架 (Miltenyi)
  4. 水浴锅
  5. 台式冷冻离心机 (Thermo, model: LEGEND RT+)
  6. 恒温培养箱 
  7. 旋转仪
  8. 细胞颗粒计数仪 (Beckman, model: Coulter Z2)
  9. 旋涡混匀器 (配抗体mix)
  10. BD FACS 流式细胞仪 (BD, model: BD LSRFortessa),配置 3B-6V-4YG-3R-2UV (表2)

    表2. 流式细胞仪激光器配置信息

实验步骤

一、 收集细胞

  1. 收集所有淋巴结 (腹股沟、腋窝、臂) 或脾脏 (具体操作步骤详见视频1~2),放在6孔板中,每孔含1 ml消化液。
    注:如果同时分离淋巴结和脾脏,将淋巴结和脾脏分成两个孔。

    视频1. 收集淋巴结步骤

    视频2. 收集和解剖脾脏步骤

  2. 对于脾脏,先用1 ml带针注射器吸取孔中消化液冲洗脾细胞,然后用手术刀片将组织切碎,组织块应能通过1 ml移液管尖端的孔,将细胞吹打至无可见团块。并将细胞转移到15 ml离心管中,再向孔中加入4 ml消化液冲洗该孔,并合并到同一管中。对于淋巴结,用手术刀片将组织切碎,并将细胞转移到15 ml离心管中,再向孔中加入4 ml消化液冲洗该孔,并合并到同一管中。
  3. 将离心管在37 °C水浴中孵育5分钟,然后在37 °C培养箱中以大约20转/分的速度旋转20分钟 (总共25分钟的消化时间)。这一步骤对于从淋巴结和脾脏中取出血浆细胞至关重要。
    注:未消化的细胞含有更多的非特异性细胞,这些细胞将与抗AF647磁珠结合。
  4. 向每管中加入100 μl 0.5 M EDTA,并用移液枪吹散细胞聚集物。在37 °C培养箱下以大约20转/分的速度再旋转5分钟。
  5. 在50 ml离心管口放置70 μm细胞过滤筛。将消化后的细胞悬浮液倒在细胞筛上,并用注射器栓塞将剩余的组织捣碎,使之通过细胞筛。用FACS缓冲液先将消化管冲洗干净,再用FACS缓冲液冲洗细胞筛,之后用FACS缓冲液将最终体积调至40 ml,翻转50 ml离心管至细胞均匀。
  6. 细胞计数。
    注:请根据实验室具体设备情况,选择相应计数方法。
  7. 以455 x g的转速在4 °C下离心细胞5分钟,尽可能地倒出上清液。轻敲细胞颗粒使之完全松散。加入200 μl Fc Block,重新悬浮。在冰上孵育5分钟,然后进入下一步。

二、 QB-AF647染色 (Hua和Hou,2013)
  1. 加入1 μl Qb-AF647 (1.0 μg/μl,标记率10~20%)。每个样品加入1 μg Qb-AF647,轻轻敲击和晃动,混合均匀。在4 °C冰箱中避光染色30分钟。
  2. 用20 ml FACS缓冲液冲洗细胞,然后以311 x g的速度4 °C离心5分钟。倒出上清液;轻敲细胞颗粒使之完全松散。
  3. 向细胞中加入200 μl FACS缓冲液,并用移液器使之重新悬浮。
  4. 加入15 μl Anti-Alexa 647磁珠,混合均匀,4 °C孵育15分钟。
  5. 用40 ml FACS缓冲液清洗细胞,然后离心 (455 x g,5分钟4 °C)。

三、 MACS 富集 (Hua和Hou,2013)
  1. 在Midimacs磁铁上放置一个Mitenyl LS柱,并用3 ml FACS缓冲液进行预冲洗,弃废液。在柱下放置一个新的15 ml 离心管。
  2. 倒出细胞离心后的上清液,将细胞颗粒重新悬浮在3 ml FACS缓冲液中,并用40 μm细胞筛过滤。将过滤后细胞加入LS柱中,至细胞通过LS柱后,立即加入3 ml FACS缓冲液冲洗LS柱。
  3. 停止滴水后,将LS柱从磁铁上取下,放在一个新的15 ml 离心管上。
  4. 向LS柱中加入5 ml FACS缓冲液,用活塞一次推动缓冲液通过。
  5. 离心收集细胞 (311 x g,5分钟,4 °C离心)。用100 μl FACS缓冲液重新悬浮细胞。
  6. 细胞计数。
    注:请根据实验室具体设备情况,选择相应计数方法。
  7. 根据细胞计数结果,取1 x 106细胞在96孔U型板中。

四、 样品染色 (表3)

表3. 流式染色配置方案

  1. 按照以上染色方案预先配制好抗体单染管和样品管溶液,离心96孔板 (863 x g,1分钟,4 °C),除去上清液,轻轻拍打板两侧使细胞颗粒松动;
  2. (可选) 对于小鼠来源的单克隆抗体染色,或对于可能受染色抗体的FC段结合影响的弱信号,用0.5 μg纯化的anti-CD16/32单克隆抗体 (最终10 μg/ml) 在4 °C下阻断Ig-fc受体 (fcr) 15分钟;
  3. 将Un-stain管细胞重新悬浮在50 μl/孔FACS缓冲液中;其余单染管和样品管分别加入50 μl预先配制好已加入抗体的单染管和样品管溶液,4 °C避光染色30分钟;(对于Biotin和SA的染色,先Biotin再SA,均是4 °C避光染色30分钟);
  4. 在每个孔中加入200 μl的FACS缓冲液,以清洗细胞;
  5. 离心96孔板 (863 x g,1分钟,4 °C),除去上清液,轻轻拍打板两侧使细胞颗粒松动;
  6. 再次重复清洗步骤;
  7. 向细胞中加入200 μl的FACS缓冲液,并将所有细胞转移到冰上的流式上机管中;
  8. 需胞内染色的样品,在表面染色完成后,加入100 μl BD Cytofix/Cytoperm 缓冲液 (100 μl/106 个细胞),4 °C避光,孵育 20 分钟,对细胞进行固定破膜;
  9. 4 °C,863 x g,离心 1 分钟,弃去固定液;
  10. 加入 200 μl BD 1 x Cytoperm/Wash缓冲液,4 °C,863 x g,离心 1 分钟,弃去固定液,重复洗 2 遍;
  11. 配制染胞内的抗体混合液 (1:200于BD 1 x Cytoperm/Wash 缓冲液),50 μl每个样品,充分混匀后,4 °C避光孵育 30 分钟;
  12. 用 200 μl BD 1 x Cytoperm/Wash缓冲液重复清洗 2 遍;
  13. 200 μl FACS缓冲液重悬细胞,转移至流式管,即可用于流式细胞仪检测。

五、 上机检测流程
  1. 依次创建 New Folder> Experiment > Specimen > Tube。
  2. 在 Parameters 窗口中保留:Alexa Fluor 647、PE-CF594、PE-Cy7、BV711、AF700、APC-Cy7、PE、PerCP-Cy5.5、EF450。
  3. 在菜单栏中选择 Experiment > Compensation Setup> Create Compensation Controls,点击 OK。自动生成名称为 Compensation Control 的 Specimen,包含阴性对照管及各单染补偿管。
  4. 上阴性对照管,调节 FSC/SSC 电压,使 P1 门圈中样本群,单击右键,将 P1 门应用到所有补偿对照管。
  5. 将各单染管依次上样,调整电压,确认阳性群低于各荧光通道的最高检测范围。
  6. 依次记录各单染管,重新命名补偿名称,并链接应用补偿,记录样本管。

结果与分析

实验结果见图1。


图1. 野生型小鼠Qb免疫11天后通过富集Qb-AF647+细胞,从中gate出发生了类别转换的记忆细胞,检测各Ig亚型的比例 (Liao等,2017)

失败经验

  1. 使细胞和所用到的缓冲液和试剂尽可能地保持在冰上。
  2. 细胞离心后,请用力拍打96孔板以致细胞颗粒松散。
  3. 96孔U型板需要移液时尽量用排枪,以免加错孔。
  4. 操作过程动作轻柔,尽量避光,于冰上操作;排枪加样、混匀时应小心细致,防止样品污染。

溶液配方

  1. 消化液
    RPMI-1640
    25 mM HEPES pH 7.4 (来自1 M原液)
    胶原酶II 200 μg/ml (来自4,000 μg /ml原液)
    DNase I 100 μg/ml (来自10 mg/ml原液)
    新鲜制备,每个样品5 ml,准备收集细胞时预热至37 °C
  2. FC block
    100 μg/ml的anti-CD16/32抗体
    2% 大鼠血清
    溶于FACS缓冲液 (制备200 μl/样品)
  3. FACS缓冲液
    2% FCS
    2 mM EDTA
    0.1% NaN3
    溶于PBS (预冷)
    4. 0.5 M EDTA
    将18.6 g EDTA·2H2O溶于80 ml超纯水中
    用NaOH调PH值至8.0,并高温高压灭菌
    最终调整至10 mM

致谢

侯百东实验室的工作得到中国科学院,国家自然科学基金和国家科技重大专项的支持。本文实验方案改编自本实验室的发表文章Liao等 (2017) 和Hua和Hou (2013)。

参考文献

  1. Hua, Z. and Hou, B. (2013). TLR signaling in B-cell development and activation. Cell Mol Immunol 10(2): 103-106.
  2. Liao, W., Hua, Z., Liu, C., Lin, L., Chen, R. and Hou, B. (2017). Characterization of T-dependent and T-independent B cell responses to a virus-like particle. J Immunol 198(10): 3846-3856.
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Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:刘懿蕃, 华兆琳, 侯百东. (2019). B细胞抗体类别的流式检测. Bio-101: e1010342. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010342.
How to cite: Liu, Y. F., Hua, Z. L. and Hou, B. D. (2019). The Detection of B Cell Antibody Isotype by Flow cytometry. Bio-101: e1010342. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010342.
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