The Detection of B Cell Antibody Isotype by Flow cytometry   

材料与试剂

1. 5 ml 流式管
2. 枪尖若干：2 µl、20 µl、100 µl、200 µl 和 1 ml
3. 40 μm和70 μm过滤筛
4. U型底96孔板
5. 六孔板
6. 15 ml、50 ml离心管
7. 1 ml带针注射器
8. 解剖工具和烧杯
9. 可放置5 ml流式管的试管架 2~3 个
10. Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 MicroBeads (Miltenyi, catalog number: 130-091-395)
11. LS Separation columns (Miltenyi, catalog number: 130-042-401)
12. 小鼠 (C57BL/6小鼠，雌雄不限，8周以上，数量根据实验需求安排)
13. 大鼠血清
14. Anti-CD16/32抗体
15. DNase I 10 mg/ml (Worthington，catalog number: LS002140，溶剂为20 mM Tris，1 mM MgCl2，PH 7.5)
16. Collagenase 4,000 U/mg (Worthington，catalog number: LS004177，溶剂为PBS)
17. Qb-AF647 (荧光蛋白) (Qb为实验室自行表达纯化，用AF647标记试剂盒 (Invitrogen, catalog number: A20173) 标记Qb，合成Qb-AF647)
18. FCS
    
19. 流式抗体 (表1)
    
    表1. 流式抗体详细信息
    
    
    
20. PBS 溶液和蒸馏水 (0.22 µm 滤膜过滤)
21. RPMI-1640 (HyClone, catalog number: SH30809.01)
22. HEPES (25 mM, PH 7.4) (Sigma-Aldrich, catalog number: H3375，溶剂为ddH2O)
23. EDTA·2H₂O
24. NaN₃
25. Tris
26. MgCl₂
27. NaOH
28. BD Cytofix/Cytoperm缓冲液
29. BD 1 x Cytoperm/Wash缓冲液
30. 消化液 (见溶液配方)
31. FC block (见溶液配方)
32. FACS缓冲液 (见溶液配方)
33. 0.5 M EDTA (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 10 µl、200 µl、1,000 µl移液枪
2. 12通道200 µl排枪
3. 磁力架 (Miltenyi)
4. 水浴锅
5. 台式冷冻离心机 (Thermo, model: LEGEND RT+)
6. 恒温培养箱 
7. 旋转仪
8. 细胞颗粒计数仪 (Beckman, model: Coulter Z2)
9. 旋涡混匀器 (配抗体mix)
10. BD FACS 流式细胞仪 (BD, model: BD LSRFortessa)，配置 3B-6V-4YG-3R-2UV (表2)
    
    表2. 流式细胞仪激光器配置信息
    
    

实验步骤

一、 收集细胞

1. 收集所有淋巴结 (腹股沟、腋窝、臂) 或脾脏 (具体操作步骤详见视频1~2)，放在6孔板中，每孔含1 ml消化液。
   注：如果同时分离淋巴结和脾脏，将淋巴结和脾脏分成两个孔。
   
   
   
   视频1. 收集淋巴结步骤
   
   
   
   视频2. 收集和解剖脾脏步骤
   
   
2. 对于脾脏，先用1 ml带针注射器吸取孔中消化液冲洗脾细胞，然后用手术刀片将组织切碎，组织块应能通过1 ml移液管尖端的孔，将细胞吹打至无可见团块。并将细胞转移到15 ml离心管中，再向孔中加入4 ml消化液冲洗该孔，并合并到同一管中。对于淋巴结，用手术刀片将组织切碎，并将细胞转移到15 ml离心管中，再向孔中加入4 ml消化液冲洗该孔，并合并到同一管中。
3. 将离心管在37 °C水浴中孵育5分钟，然后在37 °C培养箱中以大约20转/分的速度旋转20分钟 (总共25分钟的消化时间)。这一步骤对于从淋巴结和脾脏中取出血浆细胞至关重要。
   注：未消化的细胞含有更多的非特异性细胞，这些细胞将与抗AF647磁珠结合。
4. 向每管中加入100 μl 0.5 M EDTA，并用移液枪吹散细胞聚集物。在37 °C培养箱下以大约20转/分的速度再旋转5分钟。
5. 在50 ml离心管口放置70 μm细胞过滤筛。将消化后的细胞悬浮液倒在细胞筛上，并用注射器栓塞将剩余的组织捣碎，使之通过细胞筛。用FACS缓冲液先将消化管冲洗干净，再用FACS缓冲液冲洗细胞筛，之后用FACS缓冲液将最终体积调至40 ml，翻转50 ml离心管至细胞均匀。
6. 细胞计数。
   注：请根据实验室具体设备情况，选择相应计数方法。
7. 以455 x g的转速在4 °C下离心细胞5分钟，尽可能地倒出上清液。轻敲细胞颗粒使之完全松散。加入200 μl Fc Block，重新悬浮。在冰上孵育5分钟，然后进入下一步。

1. 加入1 μl Qb-AF647 (1.0 μg/μl，标记率10~20%)。每个样品加入1 μg Qb-AF647，轻轻敲击和晃动，混合均匀。在4 °C冰箱中避光染色30分钟。
2. 用20 ml FACS缓冲液冲洗细胞，然后以311 x g的速度4 °C离心5分钟。倒出上清液；轻敲细胞颗粒使之完全松散。
3. 向细胞中加入200 μl FACS缓冲液，并用移液器使之重新悬浮。
4. 加入15 μl Anti-Alexa 647磁珠，混合均匀，4 °C孵育15分钟。
5. 用40 ml FACS缓冲液清洗细胞，然后离心 (455 x g，5分钟4 °C)。
   

1. 在Midimacs磁铁上放置一个Mitenyl LS柱，并用3 ml FACS缓冲液进行预冲洗，弃废液。在柱下放置一个新的15 ml 离心管。
2. 倒出细胞离心后的上清液，将细胞颗粒重新悬浮在3 ml FACS缓冲液中，并用40 μm细胞筛过滤。将过滤后细胞加入LS柱中，至细胞通过LS柱后，立即加入3 ml FACS缓冲液冲洗LS柱。
3. 停止滴水后，将LS柱从磁铁上取下，放在一个新的15 ml 离心管上。
4. 向LS柱中加入5 ml FACS缓冲液，用活塞一次推动缓冲液通过。
5. 离心收集细胞 (311 x g，5分钟，4 °C离心)。用100 μl FACS缓冲液重新悬浮细胞。
6. 细胞计数。
   注：请根据实验室具体设备情况，选择相应计数方法。
7. 根据细胞计数结果，取1 x 10⁶细胞在96孔U型板中。

表3. 流式染色配置方案

1. 按照以上染色方案预先配制好抗体单染管和样品管溶液，离心96孔板 (863 x g，1分钟，4 °C)，除去上清液，轻轻拍打板两侧使细胞颗粒松动；
2. (可选) 对于小鼠来源的单克隆抗体染色，或对于可能受染色抗体的FC段结合影响的弱信号，用0.5 μg纯化的anti-CD16/32单克隆抗体 (最终10 μg/ml) 在4 °C下阻断Ig-fc受体 (fcr) 15分钟；
3. 将Un-stain管细胞重新悬浮在50 μl/孔FACS缓冲液中；其余单染管和样品管分别加入50 μl预先配制好已加入抗体的单染管和样品管溶液，4 °C避光染色30分钟；(对于Biotin和SA的染色，先Biotin再SA，均是4 °C避光染色30分钟)；
   
4. 在每个孔中加入200 μl的FACS缓冲液，以清洗细胞；
5. 离心96孔板 (863 x g，1分钟，4 °C)，除去上清液，轻轻拍打板两侧使细胞颗粒松动；
6. 再次重复清洗步骤;
7. 向细胞中加入200 μl的FACS缓冲液，并将所有细胞转移到冰上的流式上机管中;
8. 需胞内染色的样品，在表面染色完成后，加入100 μl BD Cytofix/Cytoperm 缓冲液 (100 μl/106 个细胞)，4 °C避光，孵育 20 分钟，对细胞进行固定破膜；
9. 4 °C，863 x g，离心 1 分钟，弃去固定液；
10. 加入 200 μl BD 1 x Cytoperm/Wash缓冲液，4 °C，863 x g，离心 1 分钟，弃去固定液，重复洗 2 遍；
11. 配制染胞内的抗体混合液 (1:200于BD 1 x Cytoperm/Wash 缓冲液)，50 μl每个样品，充分混匀后，4 °C避光孵育 30 分钟；
12. 用 200 μl BD 1 x Cytoperm/Wash缓冲液重复清洗 2 遍；
13. 200 μl FACS缓冲液重悬细胞，转移至流式管，即可用于流式细胞仪检测。
    
    

1. 依次创建 New Folder> Experiment > Specimen > Tube。
2. 在 Parameters 窗口中保留：Alexa Fluor 647、PE-CF594、PE-Cy7、BV711、AF700、APC-Cy7、PE、PerCP-Cy5.5、EF450。
3. 在菜单栏中选择 Experiment > Compensation Setup> Create Compensation Controls，点击 OK。自动生成名称为 Compensation Control 的 Specimen，包含阴性对照管及各单染补偿管。
4. 上阴性对照管，调节 FSC/SSC 电压，使 P1 门圈中样本群，单击右键，将 P1 门应用到所有补偿对照管。
5. 将各单染管依次上样，调整电压，确认阳性群低于各荧光通道的最高检测范围。
6. 依次记录各单染管，重新命名补偿名称，并链接应用补偿，记录样本管。

结果与分析

实验结果见图1。


图1. 野生型小鼠Qb免疫11天后通过富集Qb-AF647+细胞，从中gate出发生了类别转换的记忆细胞，检测各Ig亚型的比例 (Liao等，2017)

失败经验

1. 使细胞和所用到的缓冲液和试剂尽可能地保持在冰上。
2. 细胞离心后，请用力拍打96孔板以致细胞颗粒松散。
3. 96孔U型板需要移液时尽量用排枪，以免加错孔。
4. 操作过程动作轻柔，尽量避光，于冰上操作；排枪加样、混匀时应小心细致，防止样品污染。
   

溶液配方

1. 消化液
   RPMI-1640
   25 mM HEPES pH 7.4 (来自1 M原液)
   胶原酶II 200 μg/ml (来自4,000 μg /ml原液)
   DNase I 100 μg/ml (来自10 mg/ml原液)
   新鲜制备，每个样品5 ml，准备收集细胞时预热至37 °C
2. FC block
   100 μg/ml的anti-CD16/32抗体
   2% 大鼠血清
   溶于FACS缓冲液 (制备200 μl/样品)
3. FACS缓冲液
   2% FCS
   2 mM EDTA
   0.1% NaN₃
   溶于PBS (预冷)
   4. 0.5 M EDTA
   将18.6 g EDTA·2H₂O溶于80 ml超纯水中
   用NaOH调PH值至8.0，并高温高压灭菌
   最终调整至10 mM
   

致谢

侯百东实验室的工作得到中国科学院，国家自然科学基金和国家科技重大专项的支持。本文实验方案改编自本实验室的发表文章Liao等 (2017) 和Hua和Hou (2013)。

参考文献

1. Hua, Z. and Hou, B. (2013). TLR signaling in B-cell development and activation. Cell Mol Immunol 10(2): 103-106.
2. Liao, W., Hua, Z., Liu, C., Lin, L., Chen, R. and Hou, B. (2017). Characterization of T-dependent and T-independent B cell responses to a virus-like particle. J Immunol 198(10): 3846-3856.