小鼠造血祖细胞流式分析   

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摘要:造血祖细胞 (Hematopoietic Progenitor Cells, HPCs)是由造血干细胞分化来的,具有定向分化潜能的造血前体细胞。造血祖细胞主要分为4类:common myeloid progenitors (CMPs),common lymphoid progenitors (CLPs),granulocyte-macrophage progenitors (GMPs) 和megakaryocyte-erythrocyte progenitors (MEPs)。分析造血祖细胞可研究造血干细胞向各系分化的能力。本文以小鼠骨髓组织为例,使用7色共14种抗体,对4类主要的造血祖细胞 (CMPs、CLPs、GMPs和MEPs) 进行标记。

关键词: 小鼠, 造血祖细胞, 流式细胞术

材料与试剂

  1. 6孔板
  2. 15 ml离心管
  3. 1.5 ml EP管
  4. 70 μm滤膜 (Fisherbrand, catalog number: 22363548)
  5. 小鼠 (C57BL/6J,6~8周龄,雄雌各半)
  6. 胎牛血清 (FBS,Gibco,catalog number: 10100147)
  7. 流式抗体,见表1
  8. 同型对照及单标抗体,见表 2
  9. 磷酸缓冲液 (10x PBS, Sangon biotech, catalog number: E607016-0500)
  10. 氯化铵 (天津大茂化学,catalog number: 12125-02-9)
  11. 碳酸氢钠 (Sigma-Aldrich, catalog number: S5761,500G)
  12. EDTA粉末 (鼎国,catalog number: LE568)
  13. 磷酸缓冲液 (1x PBS) (见溶液配方)
  14. 红细胞裂解液 (500 ml) (见溶液配方)

    表1. 流式抗体


    表2. 同型对照及单标抗体

仪器设备

  1. 离心机 (Eppendorf, catalog numbers: 5804R,5424R)
  2. 移液器
  3. 水浴锅
  4. 摇床
  5. 流式细胞仪 (Thermo fisher scientific, Attune NxT)

实验步骤

  1. 颈椎脱臼处死小鼠,从下腹部剪开小鼠腿部皮肤,小心剪开髋关节与踝关节,将小鼠腿部完整取出,分离肌肉,取出股骨与胫骨,置于6孔板中,加入5 ml预冷的PBS + 2% FBS中。
  2. 沿骨骺剪开骨头两端松质骨部分,用1 ml注射器吸取预冷的PBS + 2% FBS,从一端开口将骨髓从另一端开口吹出,并将两端松质骨部分剪开,将所有骨髓组织吹至预冷的PBS + 2% FBS中。
  3. 将含有骨髓组织的PBS + 2% FBS转移至15 ml离心管中,并用注射器反复吹吸打散细胞至无明显骨髓组织团块。4 °C 500 x g离心5 min,弃去上清。
  4. 按每组股骨和胫骨获取的骨髓细胞加1 ml红细胞裂解液,用红细胞裂解液重悬骨髓组织,用移液枪吹打均匀,37 °C静置5 min。裂解后加入10 ml的预冷的PBS + 2% FBS终止裂解,每管细胞准备1个新的50 ml离心管,将1个70 μm滤器置于离心管上,将上述终止裂解后的11 ml细胞悬液分次倾倒至滤器中,过滤至50 ml离心管中。4 °C 500 x g离心5 min,弃去上清。
  5. 用1 ml体积预冷的PBS + 2% FBS重悬细胞 (若细胞总数过少,如少于107个,则降低重悬体积),用PBS稀释10~100倍后用细胞计数板或流式细胞仪 (Attune NxT流式细胞仪中选择Statistic-Events/μl,得到细胞数后乘回稀释倍数即可)进行细胞计数。
  6. 取7份5 × 105细胞,调整至50 μl体积,分别加入0.5 μl单标抗体,置于摇床、冰上、避光染色1 h。
  7. 取1 × 106细胞,调整至100 μl体积,加入抗体mix,具体抗体及用量见表3及表4,置于摇床、冰上、避光染色1 h。Progenitor抗体混合液为Lineage抗体混合液和CD34,Sca-1,c-kit,CD135,IL-7R,FgRII按质量比2:1:1:1:1:1:1混合,Lineage 抗体混合液内抗体等质量混合,如表3所示,progenitor抗体混合液如表4所示。另外取7份1 × 106细胞,分别用预冷的PBS + 2% FBS调整至100 μl体积,分别加入与染色抗体等量的同型抗体混合液,置于摇床、冰上、避光染色1 h。同型抗体混合液为progenitor抗体混合液中分别用某一同型抗体替换某一标记的抗体,并按相同比例混合所得。
  8. 分别加入1 ml预冷的PBS + 2% FBS终止染色,500 x g离心5 min,弃去上清,用400 μl预冷的PBS + 2% FBS重悬细胞,在流式细胞仪中使用单标抗体管调节补偿,并进行数据收集。

    表3. Lineage抗体混合液组成


    表4. Progenitor抗体混合液组成

结果与分析

研究表明造血发育谱系为,长期造血干细胞 (Long-term HSCs,LT-HSCs) 分化为短期造血干细胞 (short-term HSCs,ST-HSCs),ST-HSCs分化为多能祖细胞 (Multipotent progenitor,MPP),MPP分化为具有定向分化能力的前体细胞如:CLPs和CMPs等。CLPs继续分化为多种种类的淋巴细胞,CMPs分化为粒系/巨噬细胞前体细胞GMPs和红系/巨核系前体细胞MEP。IL-7R标记CLPs和其他下游淋系祖细胞,CD135主要表达在较早期祖细胞和ST-HSC上,故IL-7R和CD135联用可标记CLPs。通过集落形成能力及移植实验发现,分选的各种造血祖细胞具有体内、外定向分化潜能,如:CD16/32loCD34+标记的CMPs可分化为CFU-megakaryocyte (CFU-Meg), CFU-megakaryocyte/erythroid (CFU-MegE),CFU-granulocyte/macrophage (CFU-GM),CFU-granulocyte (CFU-G) 和 CFU-macrophage (CFU-M) 等多种髓系集落;CD16/32hiCD34+标记的GMPs只可分化为CFU-M,CFU-G和CFU-GM巨噬细胞或粒系细胞集落,CD16/32loCD34-标记的MEPs只能分化为CFU-Meg,BFU-E 和 CFU-MegE巨核细胞和红系细胞的集落。而移植CD16/32loCD34+标记的CMPs可诱导受体小鼠骨髓和脾脏出现供体来源的Gr-1+/Mac-1+ 的粒单核细胞和TER119+的红系细胞;移植CD16/32hiCD34+标记的GMPs只可诱导骨髓和脾脏出现供体来源的Gr-1+/Mac-1+的粒单核细胞;移植CD16/32loCD34-标记的MEPs只可诱导骨髓和脾脏出现供体来源的TER119+的红系细胞。但移植4周后以上供体来源的细胞就会消失,提示以上造血祖细胞只有有限的自我更新能力 (Kondo等,1997; Akashi等,2000)。
图1为小鼠骨髓造血祖细胞抗体及其同型抗体划门示意图。图2为小鼠造血组细胞分析流式图示例。首先以FSC-A 和SSC-A为轴,划出主要细胞群,然后以FSC-A 和FSC-H去除黏连细胞,划出单个细胞群,再划出Lineage-细胞群,一般占单个细胞群的10%,然后划出Sca-1-c-kit+细胞群 (LK,lineage-Sca-1-c-kit+),在LK中以CD34和CD16/32为轴,根据两者的表达情况划分为GMPs、CMPs和MEPs。另外,从Lineage–细胞群出发,以IL-7R和CD135为轴,可划出IL-7R+CD135+的CLPs。


图1. 小鼠造血祖细胞抗体及其同型抗体划门示意图


图2. 小鼠造血祖细胞分析流式图

实验失败的原因分析

细胞分群不明显:

  1. 未调补偿或补偿不适合。
    *用小鼠骨髓细胞调补偿。
  2. 抗体浓度过低。
    *适度提高抗体浓度。
  3. 抗体失效。
    *抗体需避光保存于2~8 °C,避免冷冻。
    *抗体mix配好后需注意避光保存,并尽快使用。
  4. 抗体孵育时间过短。
    *适度延长抗体孵育时间。
  5. 染色没有注意避光进行。
    *染色时注意避光。
  6. 染色时没有在摇床上进行。
    *染色时应在摇床上进行,避免细胞成团聚集而染色不充分。

溶液配方

  1. 磷酸缓冲液 (1x PBS)
    使用去离子水稀释PBS (10x) (去除钙、镁离子) 至1x
  2. 红细胞裂解液 (500 ml)
    氯化铵4.15 g
    碳酸氢钠500 mg
    EDTA (粉末) 18.5 mg
    使用去离子水定容至500 ml,4 °C保存

参考文献

  1. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T. and Weissman, I. L. (2000). A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature 404(6774): 193-197.
  2. Kondo, M., Weissman, I. L. and Akashi, K. (1997). Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell 91(5): 661-672.

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:谢嘉怡, 王瑨, 赵萌. (2019). 小鼠造血祖细胞流式分析. Bio-101: e1010340. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010340.
How to cite: Xie, J. Y. Wang, J. and Zhao, M. (2019). Flow Cytometry Analysis of Mouse Bone Marrow Hematopoietic Progenitor Cells. Bio-101: e1010340. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010340.
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