小鼠造血祖细胞流式分析   

材料与试剂

1. 6孔板
2. 15 ml离心管
3. 1.5 ml EP管
4. 70 μm滤膜 (Fisherbrand, catalog number: 22363548)
5. 小鼠 (C57BL/6J，6~8周龄，雄雌各半)
6. 胎牛血清 (FBS，Gibco，catalog number: 10100147)
7. 流式抗体，见表1
8. 同型对照及单标抗体，见表 2
9. 磷酸缓冲液 (10x PBS, Sangon biotech, catalog number: E607016-0500)
10. 氯化铵 (天津大茂化学，catalog number: 12125-02-9)
11. 碳酸氢钠 (Sigma-Aldrich, catalog number: S5761，500G)
12. EDTA粉末 (鼎国，catalog number: LE568)
13. 磷酸缓冲液 (1x PBS) (见溶液配方)
14. 红细胞裂解液 (500 ml) (见溶液配方)
    
    表1. 流式抗体
    
    
    表2. 同型对照及单标抗体
    
    

仪器设备

1. 离心机 (Eppendorf, catalog numbers: 5804R，5424R)
2. 移液器
3. 水浴锅
4. 摇床
5. 流式细胞仪 (Thermo fisher scientific, Attune NxT)
   

实验步骤

1. 颈椎脱臼处死小鼠，从下腹部剪开小鼠腿部皮肤，小心剪开髋关节与踝关节，将小鼠腿部完整取出，分离肌肉，取出股骨与胫骨，置于6孔板中，加入5 ml预冷的PBS + 2% FBS中。
2. 沿骨骺剪开骨头两端松质骨部分，用1 ml注射器吸取预冷的PBS + 2% FBS，从一端开口将骨髓从另一端开口吹出，并将两端松质骨部分剪开，将所有骨髓组织吹至预冷的PBS + 2% FBS中。
3. 将含有骨髓组织的PBS + 2% FBS转移至15 ml离心管中，并用注射器反复吹吸打散细胞至无明显骨髓组织团块。4 °C 500 x g离心5 min，弃去上清。
4. 按每组股骨和胫骨获取的骨髓细胞加1 ml红细胞裂解液，用红细胞裂解液重悬骨髓组织，用移液枪吹打均匀，37 °C静置5 min。裂解后加入10 ml的预冷的PBS + 2% FBS终止裂解，每管细胞准备1个新的50 ml离心管，将1个70 μm滤器置于离心管上，将上述终止裂解后的11 ml细胞悬液分次倾倒至滤器中，过滤至50 ml离心管中。4 °C 500 x g离心5 min，弃去上清。
5. 用1 ml体积预冷的PBS + 2% FBS重悬细胞 (若细胞总数过少，如少于10⁷个，则降低重悬体积)，用PBS稀释10~100倍后用细胞计数板或流式细胞仪 (Attune NxT流式细胞仪中选择Statistic-Events/μl，得到细胞数后乘回稀释倍数即可)进行细胞计数。
6. 取7份5 × 10⁵细胞，调整至50 μl体积，分别加入0.5 μl单标抗体，置于摇床、冰上、避光染色1 h。
7. 取1 × 10⁶细胞，调整至100 μl体积，加入抗体mix，具体抗体及用量见表3及表4，置于摇床、冰上、避光染色1 h。Progenitor抗体混合液为Lineage抗体混合液和CD34，Sca-1，c-kit，CD135，IL-7R，FgRII按质量比2:1:1:1:1:1:1混合，Lineage 抗体混合液内抗体等质量混合，如表3所示，progenitor抗体混合液如表4所示。另外取7份1 × 10⁶细胞，分别用预冷的PBS + 2% FBS调整至100 μl体积，分别加入与染色抗体等量的同型抗体混合液，置于摇床、冰上、避光染色1 h。同型抗体混合液为progenitor抗体混合液中分别用某一同型抗体替换某一标记的抗体，并按相同比例混合所得。
8. 分别加入1 ml预冷的PBS + 2% FBS终止染色，500 x g离心5 min，弃去上清，用400 μl预冷的PBS + 2% FBS重悬细胞，在流式细胞仪中使用单标抗体管调节补偿，并进行数据收集。
   
   表3. Lineage抗体混合液组成
   
   
   表4. Progenitor抗体混合液组成
   
   

结果与分析

研究表明造血发育谱系为，长期造血干细胞 (Long-term HSCs，LT-HSCs) 分化为短期造血干细胞 (short-term HSCs，ST-HSCs)，ST-HSCs分化为多能祖细胞 (Multipotent progenitor，MPP)，MPP分化为具有定向分化能力的前体细胞如：CLPs和CMPs等。CLPs继续分化为多种种类的淋巴细胞，CMPs分化为粒系/巨噬细胞前体细胞GMPs和红系/巨核系前体细胞MEP。IL-7R标记CLPs和其他下游淋系祖细胞，CD135主要表达在较早期祖细胞和ST-HSC上，故IL-7R和CD135联用可标记CLPs。通过集落形成能力及移植实验发现，分选的各种造血祖细胞具有体内、外定向分化潜能，如：CD16/32^loCD34⁺标记的CMPs可分化为CFU-megakaryocyte (CFU-Meg)， CFU-megakaryocyte/erythroid (CFU-MegE)，CFU-granulocyte/macrophage (CFU-GM)，CFU-granulocyte (CFU-G) 和 CFU-macrophage (CFU-M) 等多种髓系集落；CD16/32^hiCD34⁺标记的GMPs只可分化为CFU-M，CFU-G和CFU-GM巨噬细胞或粒系细胞集落，CD16/32^loCD34^-标记的MEPs只能分化为CFU-Meg，BFU-E 和 CFU-MegE巨核细胞和红系细胞的集落。而移植CD16/32^loCD34⁺标记的CMPs可诱导受体小鼠骨髓和脾脏出现供体来源的Gr-1⁺/Mac-1⁺ 的粒单核细胞和TER119⁺的红系细胞；移植CD16/32^hiCD34⁺标记的GMPs只可诱导骨髓和脾脏出现供体来源的Gr-1⁺/Mac-1⁺的粒单核细胞；移植CD16/32^loCD34^-标记的MEPs只可诱导骨髓和脾脏出现供体来源的TER119⁺的红系细胞。但移植4周后以上供体来源的细胞就会消失，提示以上造血祖细胞只有有限的自我更新能力 (Kondo等，1997; Akashi等，2000)。
图1为小鼠骨髓造血祖细胞抗体及其同型抗体划门示意图。图2为小鼠造血组细胞分析流式图示例。首先以FSC-A 和SSC-A为轴，划出主要细胞群，然后以FSC-A 和FSC-H去除黏连细胞，划出单个细胞群，再划出Lineage^-细胞群，一般占单个细胞群的10%，然后划出Sca-1^-c-kit⁺细胞群 (LK，lineage-Sca-1^-c-kit⁺)，在LK中以CD34和CD16/32为轴，根据两者的表达情况划分为GMPs、CMPs和MEPs。另外，从Lineage–细胞群出发，以IL-7R和CD135为轴，可划出IL-7R⁺CD135⁺的CLPs。


图1. 小鼠造血祖细胞抗体及其同型抗体划门示意图


图2. 小鼠造血祖细胞分析流式图

实验失败的原因分析

细胞分群不明显：

1. 未调补偿或补偿不适合。
   *用小鼠骨髓细胞调补偿。
2. 抗体浓度过低。
   *适度提高抗体浓度。
3. 抗体失效。
   *抗体需避光保存于2~8 °C，避免冷冻。
   *抗体mix配好后需注意避光保存，并尽快使用。
4. 抗体孵育时间过短。
   *适度延长抗体孵育时间。
5. 染色没有注意避光进行。
   *染色时注意避光。
6. 染色时没有在摇床上进行。
   *染色时应在摇床上进行，避免细胞成团聚集而染色不充分。
   

溶液配方

1. 磷酸缓冲液 (1x PBS)
   使用去离子水稀释PBS (10x) (去除钙、镁离子) 至1x
2. 红细胞裂解液 (500 ml)
   氯化铵4.15 g
   碳酸氢钠500 mg
   EDTA (粉末) 18.5 mg
   使用去离子水定容至500 ml，4 °C保存
   

参考文献

1. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T. and Weissman, I. L. (2000). A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature 404(6774): 193-197.
2. Kondo, M., Weissman, I. L. and Akashi, K. (1997). Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell 91(5): 661-672.