小鼠骨髓造血干细胞流式分析   

材料与试剂

1. 15 ml离心管
2. 1.5 ml EP管
3. 70 μm滤膜 (Fisherbrand, catalog number: 22363548)
4. 小鼠 (C57BL/6J，6~8周龄，雄雌各半)
5. 胎牛血清 (FBS, Gibco，catalog number: 10100147)
6. 流式抗体，见表1
   
   表1. 流式抗体
   
   
   
7. 同型对照及单标抗体，见表2
   
   表2. 同型及单标抗体
   
   
   
8. 磷酸缓冲液 (10x PBS, Sangon biotech, catalog number: E607016-0500)
9. 氯化铵 (天津大茂化学，catalog number: 12125-02-9)
10. 碳酸氢钠 (Sigma-Aldrich, catalog number: S5761，500 G)
11. EDTA粉末 (鼎国，catalog number: LE568)
12. 磷酸缓冲液 (1x PBS) (见溶液配方)
13. 红细胞裂解液 (500 ml) (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 离心机 (Eppendorf, catalog numbers: 5804R, 5424R)
2. 移液器
3. 水浴锅
4. 摇床
5. 流式细胞仪 (Thermo fisher scientific, Attune NxT)
   

实验步骤

1. 颈椎脱臼处死小鼠，从下腹部剪开小鼠腿部皮肤，小心剪开髋关节与踝关节，将小鼠腿部完整取出，分离肌肉，取出股骨与胫骨，浸泡在预冷的PBS + 2% FBS中，置于冰上。
2. 沿骨骺剪开骨头两端松质骨部分，用1 ml注射器吸取预冷的PBS + 2% FBS，从一端开口将骨髓从另一端开口吹出，并将两端松质骨部分剪开，将所有骨髓组织吹至预冷的PBS + 2% FBS中。
3. 将含有骨髓组织的PBS + 2% FBS转移至15 ml离心管中，并用注射器反复吹吸打散细胞至无明显骨髓组织团块。
4. 4 °C 500 x g离心5 min，弃去上清。
5. 按每组股骨和胫骨获取的骨髓细胞加1 ml红细胞裂解液，用红细胞裂解液重悬骨髓组织，用移液枪吹打均匀，37 °C静置5 min。裂解后加入10 ml的预冷的PBS + 2% FBS终止裂解，每管细胞准备1个新的50 ml离心管，将1个70 μm滤器置于离心管上，将上述终止裂解后的11 ml细胞悬液分次倾倒至滤器中，过滤至50 ml离心管中。4 °C 500 x g离心5 min，弃去上清。
6. 用1 ml体积预冷的PBS + 2% FBS重悬细胞 (若细胞总数过少，如少于10⁷个，则降低重悬体积)，用PBS稀释10~100倍后用细胞计数板或流式细胞仪 (Attune NxT流式细胞仪中选择Statistic–Events/μl，得到细胞数后乘回稀释倍数即可) 进行细胞计数。
7. 取7份5 x 10⁵细胞，调整至50 μl体积，分别加入0.5 μl单标抗体，置于摇床、冰上、避光染色1 h。
8. HSC染色：取1 x 10⁶细胞，用预冷的PBS + 2% FBS调整至100 μl体积，加入抗体混合液，各抗体用量见表3及表4。置于摇床、冰上、避光染色1 h。HSC抗体混合液为Lineage抗体混合液和CD34，CD150，Sca-1，c-kit，CD48，CD135抗体按质量比2:1:1:1:1:1:1混合，Lineage 抗体混合液内抗体等质量混合，如表1所示，HSC抗体混合液如表4所示。另外取7份1x 10⁶细胞，分别用预冷的PBS + 2% FBS调整至100 μl体积，分别加入与染色等量的同型抗体混合液，置于摇床、冰上、避光染色1 h。同型抗体混合液为HSC抗体混合液中分别用某一同型抗体替换某一标记的抗体，并按相同比例混合所得。
9. 分别加入1 ml预冷的PBS + 2% FBS终止染色，4 °C 500 x g离心5 min，弃去上清，用400 μl预冷的PBS + 2%FBS重悬细胞，在流式细胞仪中使用单标抗体管调节补偿，然后进行数据收集。
   
   表3. Lineage抗体混合液组成
   
   
   表4. HSC抗体混合液组成
   
   

结果与分析

造血干细胞是具有长期自我更新，以及分化为各类成熟血细胞能力的成体干细胞。目前较常用的小鼠造血干细胞标志为Lin^-Sca1⁺cKit⁺CD150⁺CD48^- (CD150HSC) 和Lin^-Sca1⁺cKit⁺CD34^-CD135^- (Longterm HSC，LT-HSC) (Kiel等，2005; Yang等，2005)。
Lineage系列抗原 (Lin)主要表达在骨髓成熟细胞上，通过Lin阴性标记可以去除大部分成熟细胞。Sca-1表达于小鼠骨髓HSC和髓系细胞，c-kit主要表达在造血干祖细胞上，所以HSC存在于Lin^-Sca1⁺cKit⁺细胞群中。此外，淋巴细胞活化信号分子 (signaling lymphocyte activation molecule，SLAM) 家族受体是常用的HSC标记，其中CD150特异表达于拥有长期造血重建能力的HSC中 (LongTerm-HSC，LT-HSC)，CD48阳性的细胞无长期造血能力，所以使用Lin^-Sca1⁺cKit⁺CD150⁺CD48^-即可特异标记出CD150HSC (Kiel等，2005)。另外，CD34不表达或弱表达于小鼠HSC中，CD135主要表达于拥有短期造血重建能力的ShortTerm HSC (ST-HSC)中，故使用Lin^-Sca1⁺cKit⁺CD34^-CD135^- (LongTerm HSC) 可用于标记小鼠骨髓中的LT-HSC (Osawa等，1996; Christensen 和 Weissman，2001; Yang等，2005)。
图1 为小鼠骨髓造血干细胞各抗体及其同型抗体画门流式示意图。图2为小鼠造血干细胞分析流式图示例。首先以FSC-A 和SSC-A为轴，画出主要细胞群，然后以FSC-A和FSC-H去除黏连细胞，画出单个细胞群，再画出Lin^-细胞群，一般占单个细胞群的10%，然后画出Sca1⁺cKit⁺细胞群 (LSK， Lin^-Sca1⁺cKit⁺)，接下来可根据实验需要画出CD150⁺CD48^- (CD150HSC) 或CD34^-CD135^- (LT-HSC)、CD34⁺CD135^- (ST-HSC) 和CD34⁺CD135⁺ (Multipotent Progenitor，MPP)。


图1. 小鼠骨髓造血干细胞各抗体及其同型抗体画门流式示意图


图2. 小鼠造血干细胞分析流式图

实验失败的原因分析

细胞分群不明显：

1. 未调补偿或补偿不适合。
   *用小鼠骨髓细胞调补偿。
2. 抗体浓度过低。
   *适度提高抗体浓度。
3. 抗体失效。
   *抗体需避光保存于2~8 °C，避免冷冻。
   *抗体mix配好后需注意避光保存，并尽快使用。
4. 抗体孵育时间过短。
   *适度延长抗体孵育时间。
5. 染色没有注意避光进行。
   *染色时注意避光。
6. 染色时没有在摇床上进行。
   *染色时应在摇床上进行，避免细胞成团聚集而染色不充分。
   

溶液配方

1. 磷酸缓冲液 (1x PBS)
   使用去离子水稀释PBS (10x) (去除钙、镁离子) 至1x
2. 红细胞裂解液 (500 ml)
   氯化铵4.15 g
   碳酸氢钠500 mg
   EDTA (粉末) 18.5 mg
   使用去离子水定容至500 ml，4 °C保存
   

参考文献

1. Christensen, J. L. and Weissman, I. L. (2001). Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: a simple method to isolate long-term stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 98(25): 14541-14546.
2. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C. and Morrison, S. J. (2005). SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell 121(7): 1109-1121.
3. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H. and Nakauchi, H. (1996). Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science 273(5272): 242-245.
4. Yang, L., Bryder, D., Adolfsson, J., Nygren, J., Mansson, R., Sigvardsson, M. and Jacobsen, S. E. (2005). Identification of Lin(-)Sca1(+)kit(+)CD34(+)Flt3- short-term hematopoietic stem cells capable of rapidly reconstituting and rescuing myeloablated transplant recipients. Blood 105(7): 2717-2723.