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小鼠骨髓造血干细胞流式分析   

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摘要:造血干细胞 (Hematopoietic Stem Cells, HSCs) 是具有长期自我更新,以及分化为各类成熟血细胞能力的成体干细胞。本文以小鼠骨髓组织为例,使用7色共14种抗体,标记出在骨髓细胞中的造血干细胞。用此法标记的HSCs还可进行细胞周期、凋亡等实验,并可用于分选实验。

关键词: 小鼠, 造血干细胞, 流式细胞术

材料与试剂

  1. 15 ml离心管
  2. 1.5 ml EP管
  3. 70 μm滤膜 (Fisherbrand, catalog number: 22363548)
  4. 小鼠 (C57BL/6J,6~8周龄,雄雌各半)
  5. 胎牛血清 (FBS, Gibco,catalog number: 10100147)
  6. 流式抗体,见表1

    表1. 流式抗体


  7. 同型对照及单标抗体,见表2

    表2. 同型及单标抗体


  8. 磷酸缓冲液 (10x PBS, Sangon biotech, catalog number: E607016-0500)
  9. 氯化铵 (天津大茂化学,catalog number: 12125-02-9)
  10. 碳酸氢钠 (Sigma-Aldrich, catalog number: S5761,500 G)
  11. EDTA粉末 (鼎国,catalog number: LE568)
  12. 磷酸缓冲液 (1x PBS) (见溶液配方)
  13. 红细胞裂解液 (500 ml) (见溶液配方)

仪器设备

  1. 离心机 (Eppendorf, catalog numbers: 5804R, 5424R)
  2. 移液器
  3. 水浴锅
  4. 摇床
  5. 流式细胞仪 (Thermo fisher scientific, Attune NxT)

实验步骤

  1. 颈椎脱臼处死小鼠,从下腹部剪开小鼠腿部皮肤,小心剪开髋关节与踝关节,将小鼠腿部完整取出,分离肌肉,取出股骨与胫骨,浸泡在预冷的PBS + 2% FBS中,置于冰上。
  2. 沿骨骺剪开骨头两端松质骨部分,用1 ml注射器吸取预冷的PBS + 2% FBS,从一端开口将骨髓从另一端开口吹出,并将两端松质骨部分剪开,将所有骨髓组织吹至预冷的PBS + 2% FBS中。
  3. 将含有骨髓组织的PBS + 2% FBS转移至15 ml离心管中,并用注射器反复吹吸打散细胞至无明显骨髓组织团块。
  4. 4 °C 500 x g离心5 min,弃去上清。
  5. 按每组股骨和胫骨获取的骨髓细胞加1 ml红细胞裂解液,用红细胞裂解液重悬骨髓组织,用移液枪吹打均匀,37 °C静置5 min。裂解后加入10 ml的预冷的PBS + 2% FBS终止裂解,每管细胞准备1个新的50 ml离心管,将1个70 μm滤器置于离心管上,将上述终止裂解后的11 ml细胞悬液分次倾倒至滤器中,过滤至50 ml离心管中。4 °C 500 x g离心5 min,弃去上清。
  6. 用1 ml体积预冷的PBS + 2% FBS重悬细胞 (若细胞总数过少,如少于107个,则降低重悬体积),用PBS稀释10~100倍后用细胞计数板或流式细胞仪 (Attune NxT流式细胞仪中选择Statistic–Events/μl,得到细胞数后乘回稀释倍数即可) 进行细胞计数。
  7. 取7份5 x 105细胞,调整至50 μl体积,分别加入0.5 μl单标抗体,置于摇床、冰上、避光染色1 h。
  8. HSC染色:取1 x 106细胞,用预冷的PBS + 2% FBS调整至100 μl体积,加入抗体混合液,各抗体用量见表3及表4。置于摇床、冰上、避光染色1 h。HSC抗体混合液为Lineage抗体混合液和CD34,CD150,Sca-1,c-kit,CD48,CD135抗体按质量比2:1:1:1:1:1:1混合,Lineage 抗体混合液内抗体等质量混合,如表3所示,HSC抗体混合液如表4所示。另外取7份1x 106细胞,分别用预冷的PBS + 2% FBS调整至100 μl体积,分别加入与染色等量的同型抗体混合液,置于摇床、冰上、避光染色1 h。同型抗体混合液为HSC抗体混合液中分别用某一同型抗体替换某一标记的抗体,并按相同比例混合所得。
  9. 分别加入1 ml预冷的PBS + 2% FBS终止染色,4 °C 500 x g离心5 min,弃去上清,用400 μl预冷的PBS + 2%FBS重悬细胞,在流式细胞仪中使用单标抗体管调节补偿,然后进行数据收集。

    表3. Lineage抗体混合液组成


    表4. HSC抗体混合液组成

结果与分析

造血干细胞是具有长期自我更新,以及分化为各类成熟血细胞能力的成体干细胞。目前较常用的小鼠造血干细胞标志为Lin-Sca1+cKit+CD150+CD48- (CD150HSC) 和Lin-Sca1+cKit+CD34-CD135- (Longterm HSC,LT-HSC) (Kiel等,2005; Yang等,2005)。
Lineage系列抗原 (Lin)主要表达在骨髓成熟细胞上,通过Lin阴性标记可以去除大部分成熟细胞。Sca-1表达于小鼠骨髓HSC和髓系细胞,c-kit主要表达在造血干祖细胞上,所以HSC存在于Lin-Sca1+cKit+细胞群中。此外,淋巴细胞活化信号分子 (signaling lymphocyte activation molecule,SLAM) 家族受体是常用的HSC标记,其中CD150特异表达于拥有长期造血重建能力的HSC中 (LongTerm-HSC,LT-HSC),CD48阳性的细胞无长期造血能力,所以使用Lin-Sca1+cKit+CD150+CD48-即可特异标记出CD150HSC (Kiel等,2005)。另外,CD34不表达或弱表达于小鼠HSC中,CD135主要表达于拥有短期造血重建能力的ShortTerm HSC (ST-HSC)中,故使用Lin-Sca1+cKit+CD34-CD135- (LongTerm HSC) 可用于标记小鼠骨髓中的LT-HSC (Osawa等,1996; Christensen 和 Weissman,2001; Yang等,2005)。
图1 为小鼠骨髓造血干细胞各抗体及其同型抗体画门流式示意图。图2为小鼠造血干细胞分析流式图示例。首先以FSC-A 和SSC-A为轴,画出主要细胞群,然后以FSC-A和FSC-H去除黏连细胞,画出单个细胞群,再画出Lin-细胞群,一般占单个细胞群的10%,然后画出Sca1+cKit+细胞群 (LSK, Lin-Sca1+cKit+),接下来可根据实验需要画出CD150+CD48- (CD150HSC) 或CD34-CD135- (LT-HSC)、CD34+CD135- (ST-HSC) 和CD34+CD135+ (Multipotent Progenitor,MPP)。


图1. 小鼠骨髓造血干细胞各抗体及其同型抗体画门流式示意图


图2. 小鼠造血干细胞分析流式图

失败经验

细胞分群不明显

  1. 未调补偿或补偿不适合。
    *用小鼠骨髓细胞调补偿。
  2. 抗体浓度过低。
    *适度提高抗体浓度。
  3. 抗体失效。
    *抗体需避光保存于2~8 °C,避免冷冻。
    *抗体mix配好后需注意避光保存,并尽快使用。
  4. 抗体孵育时间过短。
    *适度延长抗体孵育时间。
  5. 染色没有注意避光进行。
    *染色时注意避光。
  6. 染色时没有在摇床上进行。
    *染色时应在摇床上进行,避免细胞成团聚集而染色不充分。

溶液配方

  1. 磷酸缓冲液 (1x PBS)
    使用去离子水稀释PBS (10x) (去除钙、镁离子) 至1x
  2. 红细胞裂解液 (500 ml)
    氯化铵4.15 g
    碳酸氢钠500 mg
    EDTA (粉末) 18.5 mg
    使用去离子水定容至500 ml,4 °C保存

参考文献

  1. Christensen, J. L. and Weissman, I. L. (2001). Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: a simple method to isolate long-term stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 98(25): 14541-14546.
  2. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C. and Morrison, S. J. (2005). SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell 121(7): 1109-1121.
  3. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H. and Nakauchi, H. (1996). Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science 273(5272): 242-245.
  4. Yang, L., Bryder, D., Adolfsson, J., Nygren, J., Mansson, R., Sigvardsson, M. and Jacobsen, S. E. (2005). Identification of Lin(-)Sca1(+)kit(+)CD34(+)Flt3- short-term hematopoietic stem cells capable of rapidly reconstituting and rescuing myeloablated transplant recipients. Blood 105(7): 2717-2723.
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Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:谢嘉怡, 王瑨, 赵萌. (2019). 小鼠骨髓造血干细胞流式分析. Bio-101: e1010339. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010339.
How to cite: Xie, J. Y., Wang, J. and Zhao, M. (2019). Flow Cytometry Analysis of Mouse Bone Marrow Hematopoietic Stem Cells. Bio-101: e1010339. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010339.
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