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小鼠骨髓与骨内膜间充质干细胞分析   

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摘要:骨髓间充质干细胞 (Mesenchymal Stromal Cells,MSCs) 是骨髓中具有自我更新能力,和成骨、成软骨和成脂肪多向分化潜能的成体干细胞。MSC具有在体外形成纤维细胞集落 (CFU-F) 和在体内、外分化为骨、软骨和脂肪细胞的能力。本文以小鼠骨髓组织为例,使用5种一抗和1种二抗,介绍在骨髓腔和骨内膜分离、标记MSC的方法,用此法标记的MSCs还可进行细胞周期、凋亡等实验。

关键词: 小鼠, 间充质干细胞, 流式细胞术

材料与试剂

  1. 15 ml离心管
  2. 1.5 ml EP管
  3. 70 μm滤膜 (Fisherbrand, catalog number: 22363548)
  4. 小鼠 (C57BL/6J,6~8周龄,雄雌各半)
  5. 胎牛血清 (FBS, Gibco, catalog number: 10100147)
  6. Liberase (Roche, catalog number: 5401020001)
  7. DNase I (Roche, catalog number: 10104159001)
  8. 流式抗体如表1

    表1. 流式抗体


  9. 同型对照抗体如表 2

    表2. 同型对照抗体


  10. 磷酸缓冲液 (10x PBS, Sangon biotech, catalog number: E607016-0500)
  11. 氯化铵 (天津大茂化学,catalog number: 12125-02-9)
  12. 碳酸氢钠 (Sigma-Aldrich, catalog number: S5761,500G)
  13. EDTA粉末 (鼎国,catalog number: LE568)
  14. 7-AAD (Biolegend, catalog number: 420404, 50 µg/ml)
  15. HBSS (Corning, catalog number: 26616008)
  16. MSC消化酶 (见溶液配方)
  17. 磷酸缓冲液 (1x PBS) (见溶液配方)
  18. 红细胞裂解液 (500 ml) (见溶液配方)

仪器设备

  1. 离心机 (Eppendorf, catalog numbers: 5804R, 5424R)
  2. 移液器
  3. 水浴锅
  4. 恒温摇床
  5. 摇床
  6. 流式细胞仪 (Thermo fisher scientific, Attune NxT)

实验步骤

  1. 37 °C水浴预热MSC消化酶 (配制方法见“溶液配方”部分),37 °C预热摇床,冰上预冷PBS + 2% FBS。
  2. 颈椎脱臼处死小鼠,从下腹部剪开小鼠腿部皮肤,小心剪开髋关节与踝关节,将小鼠腿部完整取出,分离肌肉,取出股骨与胫骨,浸泡在预冷的PBS + 2% FBS中,置于冰上。 
  3. 骨髓、骨内膜MSC取材
    3.1
    骨髓MSC取材:小心沿骨骺剪开松质骨部分 (图1,沿虚线部分剪开),用1 ml注射器吸取0.5 ml预冷的PBS + 2% FBS,将骨髓组织完整冲出至1.5 ml EP管中,1条股骨与1条胫骨骨髓置于同一个EP管中,冰上静置5 min,吸去多余PBS。每管骨髓组织加入750 μl预热的MSC消化酶,轻轻颠倒后置于37 °C水浴锅中10 min,期间拿起颠倒数次。
    3.2
    骨内膜MSC取材:冲出骨髓后剩下的1条股骨与1条胫骨骨组织置于PBS + 2% FBS中,仔细剪碎骨组织,剪碎至骨髓腔完全暴露,且碎片面积小于5 mm2 (图2),将骨组织置于750 μl预热的MSC消化酶中,轻轻颠倒后置于37 °C水浴锅中10 min,期间拿起颠倒数次。
  4. 将上述骨髓组织或骨组织与消化酶的混合物侧放于37 °C 160~220 rpm摇床中,消化20 min。
  5. 消化后室温静置5 min,取上清约700 μl消化液加入至10 ml预冷PBS + 2% FBS进行中和,注意不要吸取未消化的骨髓组织。
  6. 骨髓组织或骨组织中再加入750 μl预热的MSC消化酶,重复第4、5步进行第2次消化,消化后尽量吸净消化液,加入至第5步的中和后消化液中。
  7. 将2次消化后的中和后消化液于4 °C 500 x g离心5 min,弃去上清,每管加入1 ml红细胞裂解液,重悬骨髓组织,用移液枪轻柔吹打均匀,37 °C静置5 min后加入10 ml的预冷的PBS + 2% FBS终止裂解,每管细胞准备1个新的50 ml离心管,将1个70 μm滤器置于离心管上,将上述终止裂解后的11 ml细胞悬液分次倾倒至滤器中,过滤至50 ml离心管中。4 °C 500 x g离心5 min,弃去上清。
  8. 用适当体积预冷的PBS + 2% FBS重悬沉淀,用细胞计数板或流式细胞仪进行细胞计数。
  9. 取3份3 × 106细胞,调整至150 μl体积,加入2 μl (0.5 mg/ml) Purified CD16/32,置于冰上、80 rpm摇床上封闭30 min。
  10. 其中1份细胞封闭后各加入1 μl以下抗体:Ter-119-APC,CD45-APC,Pdgfrα-SuperBright 436,LepR-biotin,加入0.2 μl CD31-PE/Cy7;1份细胞封闭后加入1 μl以下抗体:Ter-119-APC-iso,CD45-APC-iso,Pdgfrα-SuperBright 436,LepR-biotin; 另1份细胞封闭后加入1 μl以下抗体:Ter-119-APC,CD45-APC,Pdgfrα-SuperBright 436-iso,LepR-biotin-iso。以上3份细胞避光置于冰上、80 rpm摇床上孵育1 h。
  11. 分别加入1 ml PBS + 2% FBS终止染色,500 x g离心5 min,弃去上清,150 μl预冷的PBS + 2%FBS重悬,加入1 μl (0.2 mg/ml) Streptavidin- APC/Cy7,置于冰上、80 rpm摇床上孵育30 min。
  12. 分别加入1 ml PBS + 2% FBS终止染色,500 x g离心5 min,弃去上清,400 μl预冷的PBS + 2% FBS重悬,每管加入5 μl (50 µg/ml) 7-AAD,混匀后使用流式细胞仪收集数据。

结果与分析

小鼠骨髓MSCs在Pdgfrα+和LepR+的细胞中富集,也有部分骨髓来源的MSC表达CD51,并且上述3个标记物有较高的共表达比例 (Morikawa等,2009; Zhou等,2014; Yue等,2016)。还有报道发现,Nestin-GFP (Mendez-Ferrer等,2010),Gli1-cre (Zhao等,2014; Schneider等,2017),Gremlin 1 (Worthley等,2015) 和N-cadherin (Zhao等,2019) 可富集骨髓MSCs,但这些分子标记物需要依赖荧光报告工具小鼠,故在此不介绍具体方法。在此,我们使用的小鼠骨髓和骨内膜间充质干细胞的标志为CD45-Ter-119- CD31- LepR+或CD45- Ter-119- CD31- Pdgfrα+
        图3为同型对照的结果及画门标准,图4和图5分别为骨髓和骨内膜间充质干细胞分析流式图和画门方法。首先以FSC-A 和SSC-A 为轴,画出主要细胞群,然后以FSC-A 和FSC-H去除粘连细胞,画出单个细胞群,再根据7-AAD画出活细胞群(7-AAD-)。接下来根据实验需要画出CD45- Ter-119- CD31- LepR+和CD45- Ter-119- CD31- Pdgfrα+细胞群,由流式结果可以得出,在骨髓和骨内膜MSC中LepR和Pdgfrα均有较高的共表达比例。


图1. 小鼠股骨 (左)与胫骨 (右),虚线表示剪开的地方


图2. 骨内膜MSC取材示意图


图3. LepR 与Pdgfrα同型对照结果及画门标准


图4. 小鼠骨髓间充质干细胞分析流式图


图5. 小鼠骨内膜间充质干细胞分析流式图

失败经验

骨髓组织未被消化:

  1. 消化酶活性丧失。
    *MSC消化酶配好后-20 °C冰箱保存,尽快使用。
  2. 消化未在37 °C 160~220 rpm摇床中进行。
    *需保证震荡的转速达160~220 rpm及消化时温度维持至37 °C。

无明显MSC分群:

  1. 消化过度或不足。
    *适当调整消化时间,消化骨髓组织时消化至没有肉眼可见骨髓组织为宜。
  2. 消化酶活性不足。
    *Liberase干粉-20 °C冰箱保存,MSC消化酶配好后-20 °C冰箱保存,尽快使用。
    *MSC消化酶使用前需在37 °C先预热,加入骨髓组织后先在37 °C水浴锅中孵育10 min,摇床需提前设定37 °C,保证震荡消化时温度维持至37 °C。
  3. DNase I 未添加或浓度不够。
    *DNase I的作用为消化细胞破裂后释放的游离DNA,过多的游离DNA会缠绕细胞,导致消化不充分。但不同批号DNase I的质量与活性单位的换算比例不同,此处使用Roche公司DNase I (10104159001)。
  4. 使用了无钙离子的HBSS。
    *DNase I 需在钙离子存在下发挥消化作用,故需使用添加了钙离子的HBSS。
  5. 一抗或二抗浓度过低。
    *适当提高抗体浓度。
  6. 抗体孵育时间过短。
    *适当延长孵育时间。
  7. 置于室温孵育。
    *置于室温孵育易导致非特异结合增加,应置于冰上摇床孵育。
  8. 置于4 °C冰箱静置孵育。
    *应在约80 rpm摇床中孵育。

溶液配方

  1. MSC消化酶
    Liberase 5 mg
    DNase I 250 μl (20 mg/ml) 溶于25 ml HBSS
    -20 °C保存
  2. 磷酸缓冲液 (1x PBS)
    使用去离子水稀释PBS (10x) (去除钙、镁离子) 至1x
  3. 红细胞裂解液 (500 ml)
    氯化铵         4.15 g
    碳酸氢钠     500 mg
    EDTA (粉末)18.5 mg
    使用去离子水定容至500 ml,4 °C保存

参考文献

  1. Mendez-Ferrer,S.,Michurina,T. V.,Ferraro,F.,Mazloom,A. R.,Macarthur,B. D.,Lira,S. A.,Scadden,D. T.,Ma'ayan,A.,Enikolopov,G. N. and Frenette,P. S. (2010). Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature 466(7308): 829-834.
  2. Morikawa,S.,Mabuchi,Y.,Kubota,Y.,Nagai,Y.,Niibe,K.,Hiratsu,E.,Suzuki,S.,Miyauchi-Hara,C.,Nagoshi,N.,Sunabori,T.,Shimmura,S.,Miyawaki,A.,Nakagawa,T.,Suda,T.,Okano,H. and Matsuzaki,Y. (2009). Prospective identification,isolation,and systemic transplantation of multipotent mesenchymal stem cells in murine bone marrow. J Exp Med 206(11): 2483-2496.
  3. Schneider,R. K.,Mullally,A.,Dugourd,A.,Peisker,F.,Hoogenboezem,R.,Van Strien,P. M. H.,Bindels,E. M.,Heckl,D.,Busche,G.,Fleck,D.,Muller-Newen,G.,Wongboonsin,J.,Ventura Ferreira,M.,Puelles,V. G.,Saez-Rodriguez,J.,Ebert,B. L.,Humphreys,B. D. and Kramann,R. (2017). Gli1+ mesenchymal stromal cells are a key driver of bone marrow fibrosis and an important cellular therapeutic target. Cell Stem Cell 20(6): 785-800 e788.
  4. Worthley,D. L.,Churchill,M.,Compton,J. T.,Tailor,Y.,Rao,M.,Si,Y.,Levin,D.,Schwartz,M. G.,Uygur,A.,Hayakawa,Y.,Gross,S.,Renz,B. W.,Setlik,W.,Martinez,A. N.,Chen,X.,Nizami,S.,Lee,H. G.,Kang,H. P.,Caldwell,J. M.,Asfaha,S.,Westphalen,C. B.,Graham,T.,Jin,G.,Nagar,K.,Wang,H.,Kheirbek,M. A.,Kolhe,A.,Carpenter,J.,Glaire,M.,Nair,A.,Renders,S.,Manieri,N.,Muthupalani,S.,Fox,J. G.,Reichert,M.,Giraud,A. S.,Schwabe,R. F.,Pradere,J. P.,Walton,K.,Prakash,A.,Gumucio,D.,Rustgi,A. K.,Stappenbeck,T. S.,Friedman,R. A.,Gershon,M. D.,Sims,P.,Grikscheit,T.,Lee,F. Y.,Karsenty,G.,Mukherjee,S. and Wang,T. C. (2015). Gremlin 1 identifies a skeletal stem cell with bone,cartilage,and reticular stromal potential. Cell 160(1-2): 269-284.
  5. Yue,R.,Zhou,B. O.,Shimada,I. S.,Zhao,Z. and Morrison,S. J. (2016). Leptin receptor promotes adipogenesis and reduces osteogenesis by regulating mesenchymal stromal cells in adult bone Marrow. Cell Stem Cell 18(6): 782-796.
  6. Zhao,H.,Feng,J.,Seidel,K.,Shi,S.,Klein,O.,Sharpe,P. and Chai,Y. (2014). Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell 14(2): 160-173.
  7. Zhao,M.,Tao,F.,Venkatraman,A.,Li,Z.,Smith,S. E.,Unruh,J.,Chen,S.,Ward,C.,Qian,P.,Perry,J. M.,Marshall,H.,Wang,J.,He,X. C. and Li,L. (2019). N-cadherin-expressing bone and marrow stromal progenitor cells maintain reserve hematopoietic stem cells. Cell Rep 26(3): 652-669 e656.
  8. Zhou,B. O.,Yue,R.,Murphy,M. M.,Peyer,J. G. and Morrison,S. J. (2014). Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell 15(2): 154-168.
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Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:谢嘉怡, 王瑨, 赵萌. (2019). 小鼠骨髓与骨内膜间充质干细胞分析. Bio-101: e1010338. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010338.
How to cite: Xie, J. Y., Wang,J. and Zhao, M. (2019). Flow Cytometry Analysis of Mouse Bone Marrow and Endosteum Mesenchymal Stromal Cells. Bio-101: e1010338. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010338.
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