摘要:活化诱导的胞嘧啶脱氨基酶 (activation induced deaminase,AID) 可引发B 细胞抗体基因的高频突变 (SHM),是B细胞内抗体多样性产生的一个重要机制。研究发现,在细菌或非B细胞 (成纤维细胞,H1299细胞等) 中过表达AID,也可导致高表达基因产生高频的SHM样突变。基于AID基因这一作用特点,结合流式细胞分选技术的应用,研究者建立了哺乳动物细胞抗体展示与体细胞高频突变结合的抗体进化平台,用于抗体或蛋白的优化。为建立这一平台,我们实验室构建了一株CHO细胞克隆 (CHO-puro细胞),该细胞株在染色体特定位点嵌入了单一的基因表达框,基因框外侧含有两个不同重组序列的DNA,便于快捷插入欲优化的抗体基因,且该位点使得插入的抗体基因能够高水平和稳定地表达。我们将以抗TNFα抗体的亲和力优化为例,详细介绍这一技术。首先,我们将TNFα抗体基因插入上面所述的CHO细胞克隆单一的基因表达框中,获得能够高水平且稳定展示TNFα抗体的CHO细胞株;然后,将AID表达质粒转入CHO细胞株,使TNFα抗体基因发生突变,随着细胞的增殖,自然形成突变抗体库;经过几轮的流式细胞分选-细胞增殖,可获得具有更高亲和力的抗TNFα抗体突变体。该技术可用于获得具有更高亲和力,特异性和稳定性的抗体,以及基于细胞表面展示和生物大分子相互作用的其他蛋白特性的优化。
关键词: 活化诱导的胞嘧啶脱氨基酶, 体细胞高频突变, 抗体进化, 亲和力成熟
材料与试剂
仪器设备
实验步骤
首先,我们通过重组替换获得能够稳定高水平展示抗TNFα抗体的CHO细胞株;然后,将AID表达质粒转染入该细胞株,使抗TNFα抗体基因发生突变;经过几轮的流式细胞分选-细胞增殖,可获得具有更高亲和力的TNFα抗体突变体 (Chen等,2016)。
注意事项
溶液配方
致谢
相关工作得到中国科学院,北京市科委和国家自然科学基金的支持。本文实验方案改编自本实验室的发表文章 Chen等 (2012),Chen等 (2016) 和An等 (2018)。
参考文献
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