Establishment of Mammalian Cell Platforms for Antibody Evolution Based on Flow Cytometry   

材料与试剂

1. 培养皿
2. 0.45 μm滤膜
3. 抗HA-PE抗体 (Abcam, catalog number: ab72564) 
4. T4 DNA连接酶 (Thermo Scientific) 
5. 异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)
6. EcoRI
7. XhoI
8. 胎牛血清 (FCS, HyClone) 
9. Anti-hFc (human Fc) kinetic grade biosensors (ForteBio, catalog number: 18-5060)
10. 细胞：
    CHO/dhFr-细胞，购自上海中国科学院细胞库
    CHO-puro细胞，在染色体特定位点嵌入了单一的基因高表达框的CHO/dhFr-细胞，由杭海英实验室建立 (Chen等，2016)
    FreeStyle^TM MAX 293F细胞，购自Invitrogen
11. 质粒：
    PET28a (+) - GFP-TNFα，用于大肠杆菌中表达GFP-TNFα蛋白
    pF2AC，用于在CHO细胞中共表达Flpo和iCre重组酶的质粒
    pFAbL，用于将抗体 (TNFα抗体) 基因通过重组替换插入CHO-puro 细胞基因组单一的基因表达框中
    pCEP-Neo-mAID，用于在CHO细胞中表达mAID
    pCEP4-scFv-hFC，用于在FreeStyle^TM MAX 293F细胞中表达scFv-hFc 融合蛋白
    以上为实验室已构建质粒，详细请参考实验室已发表文章 (Chen等，2012和2016)
12. Lipofectamine^TM 2000 (Invitrogen) 
13. 0.1 mM次黄嘌呤
14. 0.016 mM胸苷 (HT, Gibco)
15. PBS
16. 异丙醇
17. 胰蛋白胨
18. 酵母提取物
19. 卡那霉素
20. 氯化钠
21. 苯乙烯磺酰氟 (PMSF) 
22. Tris-Cl
23. 甘油
24. 咪唑
25. 新霉素
26. Bradford蛋白质检测试剂盒 (Bio-Rad) 
27. Ni Sepharose High Performance column (Amersham Biosciences) 
28. 线性聚乙烯亚胺25,000 (PEI) (Polysciences) 
29. Iscove’s Modified Dulbecco Medium (IMDM, HyClone)
30. Free-Style^TM 293表达培养基 (Invitrogen) 
31. Opti-MEM^® I减血清培养基 (Gibco) 
32. OptiPRO^TM SFM无血清培养基 (Gibco) 
33. Wizard^® SV Genomic DNA Purification System (Promega) 
34. Phusion高保真PCR试剂盒 (NEB) 
35. AxyPrep^TM DNA Gel Extraction Kit (Axygen)
36. LB培养基 (见溶液配方)
37. 50 mg/ml卡那霉素 (见溶液配方)
38. 100 mM异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) (见溶液配方)
39. 100 mM苯基甲磺酰氟 (PMSF) (见溶液配方)
40. 结合缓冲液 (见溶液配方)
41. IMDM完全培养液 (见溶液配方)
42. 100 mg/ml新霉素 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 超声仪 (南京鑫辰生物科技有限公司) 
2. 恒温振荡培养箱 (HZQ-X100)
3. Steri-Cycle CO₂培养箱 (Thermo) 
4. Shaker-Incubator Lab-Therm / LT-XC (Kuhner，瑞士) 
5. FACSCalibur (BD) 
6. FACSAria^TM IIIu (BD) 
7. S1000^TM 热循环仪 (Bio-Rad) 
8. CHB-100恒温金属浴 (Bioer) 
9. Nanodrop ND-1000分光光度计 (Thermo Scientific) 
10. Octet生物分子相互作用技术平台 (ForteBio Octet, USA) 
11. 离心机
    

实验步骤

首先，我们通过重组替换获得能够稳定高水平展示抗TNFα抗体的CHO细胞株；然后，将AID表达质粒转染入该细胞株，使抗TNFα抗体基因发生突变；经过几轮的流式细胞分选-细胞增殖，可获得具有更高亲和力的TNFα抗体突变体 (Chen等，2016)。

1. 表达和纯化GFP-TNFα抗原
   GFP-TNFα融合蛋白将被用于抗TNFα抗体的筛选 (见注意事项1)。
   1.1

   将带有His-GFP-TNFα表达质粒的Rosetta单菌落挑入5 ml LB培养基，加50 μg/ml卡那霉素，37 °C，200 rpm振荡过夜。
   1.2

   取2 ml过夜活化菌至200 ml新鲜LB培养基中，加50 μg/ml卡那霉素，37 °C，200 rpm振荡至菌液OD₆₀₀达到0.5~0.6。
   1.3

   加入IPTG至终浓度为0.4 mM，16 °C，200 rpm振荡11小时。
   1.4

   菌液2,600 x g离心10分钟，弃上清，收获细菌。
   1.5

   将菌体重悬于4 °C预冷的含有2 mM PMSF的10 ml PBS中。
   1.6

   4 °C超声破碎，16,000 x g离心30分钟，收取上清。
   1.7

   将上清添加到填有硫酸镍 (NiSO₄) 的Sepharose High Performance (Amersham Bioscience) 的层析柱中。
   1.8

   用分别含有30、60、90、和250 mM咪唑的结合缓冲液洗脱，收集洗脱液。
   1.9

   洗脱液浓缩后，用Bradford蛋白质检测试剂盒 (Bio-Rad) 检测蛋白浓度，SDS-PAGE检测蛋白纯度。
   注：在大多数情况下，GFP-TNFα的纯度大于90%。
   
   
2. 稳定高水平展示抗TNFα抗体的CHO细胞株构建
   我们实验室已构建了CHO-puro 细胞株，该细胞株在染色体特定位点嵌入了单一的基因表达框，能够高表达抗性基因 (puroR)。基因框外侧含有两个不同重组序列的DNA，故puroR可以被不同的目标DNA片段替换。作为一个例子，我们用抗TNFα抗体基因替换了puroR，获得了在细胞膜表面稳定高水平展示抗TNFα
   抗体的CHO细胞株，用于抗TNFα抗体的进化 (见注意事项2)。
   2.1

   细胞培养：

   1)

   CHO-puro细胞培养于CO₂培养箱，37 °C，5% CO₂。

   2)

   每2~3天传代。

   3)

   转染前一天，接种2×10⁶个细胞于10 cm细胞培养皿。
   2.2

   转染：
   质粒pFAbL (用于将抗TNFα抗体基因替换puroR) 和质粒pF2AC (用于表达Flpo和iCre重组酶) 共同转染CHO-puro细胞。转染液制备如下：

   1)

   16 μg pF2AC + 4 μg pFAbL + 1.2 ml Opti-MEM^® 减血清培养基，轻轻混匀。

   2)

   40 μl LipofectamineTM 2000 + 1.2 ml Opti-MEM^® 减血清培养基，轻轻混匀。室温孵育5分钟。

   3)

   将前两步中的稀释液轻轻混合，室温孵育25分钟。

   4)

   吸走CHO-puro细胞培养皿中的培养基，用PBS洗CHO-puro细胞三次，吸尽PBS。加入4 ml Opti-MEM^® 减血清培养基。

   5)

   将2.4 ml转染液 (来自步骤3) 加入细胞培养皿，轻轻晃匀。

   6)

   细胞在CO₂培养箱中，37 °C孵育6小时。
   2.3

   细胞扩增：

   1)

   转染后6小时，将细胞扩入4个10 cm培养皿。

   2)

   细胞扩增2天。
   2.4

   流式分选：

   1)

   胰酶消化细胞 (10 cm培养皿中加2 ml胰酶)，37 °C孵育2~3分钟，细胞脱落后加入含10% 血清的培养基终止胰酶作用 (见注意事项3) ，300 x g离心3分钟，收获细胞。

   2)

   PBS洗细胞：用PBS重悬细胞沉淀，300 x g离心3分钟， 吸出PBS。

   3)

   细胞标记抗体：用Opti-MEM^® 减血清培养基稀释PE标记的抗HA抗体 (1:250，抗TNFα抗体带有HA标签) ，配制成抗体染色液。所有收获的细胞加入1 ml 抗体染色液，4 °C ，25分钟。

   4)

   PBS洗细胞3次。

   5)

   1 ml Opti-MEM^® 减血清培养基重悬细胞。

   6)

   用流式细胞仪FACSAria^TM IIIu，分选出PE荧光信号最强的细胞群 (表达抗TNFα抗体的细胞群)。
   2.5

   分选后的细胞扩增：
   分选的表达抗TNFα抗体的细胞 (CHO-TNFAb) 在37 °C，5% CO₂培养箱中培养扩增。
   
   
3. 抗TNFα抗体的亲和力成熟
   经过几轮的流式细胞分选-细胞增殖，可获得具有更高亲和力的抗TNFα抗体突变体，具体实验步骤如下：
   3.1

   转染：
   抗TNFα抗体亲和力成熟的每轮步骤中，均需要用表达AID的质粒pCEP-Neo-mAID转染CHO-TNFAb细胞。

   1)

   转染前一天，接种3 × 10⁵个CHO-TNFAb细胞于6孔板中。

   2)

   2 μg pCEP-Neo-mAID + 150 μl Opti-MEM^® 减血清培养基，轻轻混匀。

   3)

   5 μl Lipofectamine^TM 2000 + 150 μl Opti-MEM^® 减血清培养基，轻轻混匀。室温孵育5分钟。

   4)

   将前两步中的稀释液轻轻混合，室温孵育25分钟。

   5)

   吸走CHO-TNFAb细胞培养皿中的培养基，用PBS洗CHO-TNFAb细胞三次，吸尽PBS。加入1 ml Opti-MEM^® 减血清培养基。

   6)

   将300 μl转染液 (来自步骤4) 加入细胞培养皿，轻轻晃匀。

   7)

   细胞在CO₂培养箱中，37 °C孵育5小时。
   3.2

   细胞扩增：
   ID表达质粒 (pCEP-Neo-mAID) 带新霉素抗性基因，转染后的细胞在含新霉素的培养基中培养7天，以使表达AID的细胞扩增。

   1)

   转染后5小时，将6孔板中的细胞扩入2个10 cm培养皿。

   2)

   加入新霉素至终浓度1 mg/ml。

   3)

   每2~3天传代一次，大约7天后，细胞数达到约6 × 10⁷。
   3.3

   展示高亲和力抗体的细胞富集：扩增后的细胞标记PE偶联的抗HA抗体 (抗TNFα抗体带HA标签，该抗体用于检测细胞上抗体展示水平) 和GFP-TNFα抗原 (用于检测细胞上抗体与抗原结合的能力) 。用流式细胞仪分选出GFP/PE荧光信号比例最高的细胞群 (最高的0.02%，约20,000个细胞)，具体实验步骤如下：

   1)

   胰酶消化细胞 (10 cm培养皿中加2 ml胰酶)，37 °C孵育2~3分钟，细胞脱落后加入含10%血清的培养基终止胰酶作用 (见注意事项3)，300 x g离心3分钟，收获细胞。

   2)

   PBS洗细胞：用PBS重悬细胞沉淀，300 x g离心3分钟，吸出PBS。

   3)

   细胞标记：用Opti-MEM^® 减血清培养基稀释PE偶联的抗HA抗体 (1:250) 和GFP-TNFα (0.2 mg/ml)，配制成抗体染色液。所有收获的细胞加入2 ml抗体染色液，4 °C，25分钟。

   4)

   PBS洗细胞3次。

   5)

   2 ml Opti-MEM^® 减血清培养基重悬细胞。

   6)

   用流式细胞仪分选出GFP/PE荧光信号比例 (“抗原结合/抗体展示”比例) 最高的细胞群 (最高的0.02%，约20,000个细胞，图1，Chen等，2016)。
   
   
   图 1. 抗体亲和力成熟。经AID 突变7天后，流式分选出“抗原结合/抗体展示”比例最高的细胞群 (最高的0.02%，约20,000个细胞). A. 框选出主细胞团 (P1)，去除死细胞；B. 对于P1细胞群，进一步框选出较小的细胞群 (P2)，去除二联体细胞或多联体细胞及较大的细胞；C. 对于P2细胞群，分选出“抗原结合/抗体展示”比例最高的细胞群 (最高的0.02%，约20,000个细胞，P3)。该图来源于我们以前发表的文章 (Chen等，2016)。
   
   
   3.4

   分选后细胞扩增：
   分选的CHO-TNFAb细胞在37 °C，5% CO₂培养箱中培养扩增。3天后细胞数量将达到200,000左右，然后用表达AID的质粒转染CHO-TNFAb细胞，进行下一轮亲和力成熟。
   
   
4. 抗TNFα抗体突变体检测
   4.1

   收获CHO-TNFAb细胞。
   4.2

   用Wizard^® SV Genomic DNA Purification System提取细胞基因组DNA，具体操作按照说明书进行。用Nanodrop ND-1000分光光度计测定DNA浓度，将其调整为100 ng/μl。
   4.3

   从基因组DNA扩增抗体基因片段。
   扩增引物：
   T7-P1：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGC-3′
   TM-P2：5′-CTAACGTGGCTTCTTCTGCCAAAGC-3′
   PCR反应体系 (50 μl) ：
   10 μl 5× HF缓冲液。
   1 μl 10 mM dNTPs
   1.5 μl DMSO
   0.5 μl Phusion^® 高保真DNA聚合酶
   2.0 μl正向引物 (10 μM)
   2.0 μl反向引物 (10 μM)。
   29 μl 去离子水 (不含核酸酶)
   4 μl DNA模板 (100 ng/μl) 。
   PCR运行程序：
   98 °C，3分钟
   98 °C，30 秒; 61 °C，30 秒; 72 °C，35 秒。30个循环
   72 °C，10分钟
   4 °C保持
   4.4

   使用AxyPrep^TM DNA Gel Extraction Kit纯化扩增的DNA片段 (1,077 bp)。
   4.5

   纯化的DNA扩增片段和pCDNA3.1质粒用EcoRI和XhoI双酶切，37 °C，2小时，然后用AxyPrep^TM DNA Gel Extraction Kit纯化酶切后的DNA片段和质粒。
   4.6

   酶切后的DNA片段和质粒连接：使用T4 DNA连接酶，16 °C反应4小时。
   4.7

   连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。在每轮分选后，按上述步骤克隆抗体基因，并对50个克隆进行测序 (见注意事项4)。由于每轮的流式细胞分选—细胞增殖具有迭代效应，导致抗体亲和力增加的有益突变将被富集。
   
   
5. 使用流式细胞仪检测抗TNFα抗体突变体与GFP-TNFα抗原的结合能力 (见注意事项5)
   5.1

   细胞培养：

   1)

   CHO/dhFr-细胞培养于CO₂培养箱，37 °C，5% CO₂。

   2)

   每2~3天传代。

   3)

   转染前一天，接种2 × 10⁵个细胞于6孔板中。
   5.2

   转染：
   用表达抗TNFα抗体突变体的pCDNA3.1质粒转染CHO/dhFr-细胞。

   1)

   2 μg质粒DNA + 150 μl Opti-MEM^® 减血清培养基，轻轻混匀。

   2)

   5 μl Lipofectamine^TM 2000 + 150 μl Opti-MEM^® 减血清培养基，轻轻混匀。室温孵育5分钟。

   3)

   将前两步中的稀释液轻轻混合，室温孵育25分钟。

   4)

   吸走CHO/dhFr-细胞培养皿中的培养基，用PBS洗CHO/dhFr-细胞三次，吸尽PBS。加入1 ml Opti-MEM^® 减血清培养基。

   5)

   将300 μl转染液 (来自步骤3) 加入细胞培养皿，轻轻晃匀。

   6)

   细胞在CO₂培养箱中，37 °C孵育5小时。吸走转染液加入细胞培养基。
   5.3

   流式检测：

   1)

   转染后两天，胰酶消化细胞 (六孔板每孔加0.5 ml胰酶)，37 °C孵育2~3分钟，细胞脱落后加入含10% 血清的培养基终止胰酶作用 (见注意事项3)，300 x g离心3分钟，收获细胞。

   2)

   PBS洗细胞：用PBS重悬细胞沉淀，300 x g离心3分钟 吸出PBS。

   3)

   细胞标记：用Opti-MEM^® 减血清培养基稀释PE偶联的抗HA抗体 (1:250) 和GFP-TNFα (0.2 mg/ml) ，配制成抗体染色液。每孔细胞加入100 μl 抗体染色液，4 °C反应25分钟。

   4)

   PBS洗细胞3次。

   5)

   0.4 ml Opti-MEM^® 减血清培养基重悬细胞，进行流式检测。图2显示突变抗体结合GFP-TNFα的能力高于野生型抗体，即这些突变抗体展示细胞的“抗原结合/抗体展示”比例大于野生型抗体展示细胞的“抗原结合/抗体展示”比例 (Chen等，2016)。
   
   
   图 2. 流式检测抗体突变体的抗原结合能力. 野生型抗体作为对照 (WT)。结果显示7个抗体突变体具有比野生型 (WT) 更高的抗原结合能力。该图来源于我们以前发表的文章 (Chen等，2016)。
   
   
6. Octet分子相互作用技术平台检测抗体亲和力
   为进一步确认流式检测中显示的抗TNFα抗体突变体结合GFP-TNFα的能力高于野生型抗体，将图2显示的七个抗体突变体基因亚克隆到pCEP4质粒，转染293F细胞，表达纯化出scFv-Fc融合蛋白，用Octet分子相互作用技术平台检测其亲和力。
   6.1

   细胞培养：

   1)

   FreeStyle^TM MAX 293F细胞用FreeStyle^TM 293 Expression Medium培养基培养，37 °C，5% CO2培养箱，120 rpm转速下摇瓶培养。

   2)

   每2~3天传代。

   3)

   转染前一天，将293F细胞按8 × 10⁵/ml接种于30 ml FreeStyle^TM 293 Expression Medium培养基中，使转染时，细胞密度达到1.2 × 10⁶/ml。
   6.2

   转染：

   1)

   45 μg质粒DNA + 2 ml OptiPRO^TM SFM Serum Free培养基，轻轻混匀。

   2)

   在上一步中加入60 μl PEI试剂，轻轻混匀。室温孵育10分钟。

   3)

   将转染液 (来自步骤2) 加入293F细胞摇瓶中。

   4)

   细胞37 °C，5% CO₂培养箱，120 rpm转速下振荡培养。
   6.3

   scFv-Fc的表达和纯化：

   1)

   转染3天后，将摇瓶内的细胞和培养基倒入50 ml离心管中。300 x g离心3分钟，去掉细胞，将培养上清倒入新的50 ml离心管中。

   2)

   4 °C，7,000 x g离心10分钟，去掉培养基中的杂质，将培养上清倒入新的50 ml离心管中。培养上清用0.45 μm的滤膜过滤。

   3)

   用30 KDa浓缩管，4,000 x g，4 °C离心浓缩，使30 ml上清液浓缩至约1.5 ml。

   4)

   SDS-PAGE考马斯亮蓝染色估计抗体浓度，用FreeStyle^TM 293 Expression Medium培养基将抗体浓度调整到100 μg/ ml。
   6.4

   Octet分子相互作用技术平台检测抗体亲和力

   1)

   将上述抗体溶液用抗人Fc片段动能传感器 [Anti-hFc kinetic grade biosensors (ForteBio:18-5060,USA)] 检测抗体的亲和力。

   2)

   检测条件为：(i) 基线 (baseline) 240 s；(ii)上样 (loading) 240 s； (iii) 基线 (baseline) 180 s； (iv) 结合 (association) 120 s，结合过程中GFP-TNFα抗原浓度分别为 1,600 nM, 800 nM, 400 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM； (v) 解离 (dissociation) 180 s。

   3)

   K_on和K_off由系统软件根据结合和解离曲线拟合得到，亲和力常数 (K_d) 通过K_off/K_on计算得出。野生型及七个突变的抗TNFα抗体K_d值如表1所示。该结果进一步确认了抗TNFα抗体突变体结合GFP-TNFα抗原的亲和力高于野生型抗体。
   
   表1. 抗体亲和力
   
   注: 该表来源于我们以前发表的文章 (Chen等，2016) 。
   

注意事项

1. 本例中，用于筛选抗TNFα抗体的抗原是GFP- TNFα融合蛋白。该融合蛋白在大
   肠杆菌中表达，TNFα直接加在了标签蛋白GFP的C端，中间没加linker。我们前期的工作证实，该融合蛋白作为抗原，可以成功筛选出具有更高亲和力的抗TNFα抗体突变体。对于其他抗原抗体对，表达用于筛选抗体的抗原时，需考虑标签蛋白的选择，标签蛋白与抗原的连接方式，中间是否加linker，选择什么样的Linker等，以保证抗原结构的正确。
2. 该过程的图示请见我们之前发表的文章 (Chen等，2016)。对于抗体展示细胞，以下两点需要注意：
   1) 为使抗体的基因型和表型有效对应，每个细胞中抗体表达基因应为单拷贝；
   2) 由于AID酶的作用特性，基因的转录水平越高，其突变率越高，故需要进化的抗体基因在细胞中应该是高转录的。
3. 使用胰酶消化细胞时需要注意，有些细胞表面展示的抗体对胰酶敏感，故需做预实验确定胰酶消化的最佳条件。对于那些对胰酶特别敏感的抗体，我们推荐用0.02% EDTA，37 °C，5分钟消化CHO细胞。
4. 对于亲和力成熟的前两轮“流式细胞分选-细胞增殖”，建议对100或150个克隆进行测序。
5. AID酶的作用靶点不仅局限于抗体基因，故我们在抗体亲和力成熟过程中流式检测到的抗体亲和力的改变可能不是因为抗体本身的突变，而是抗体展示细胞发生了改变。为排除这一可能，需要构建突变抗体表达质粒，瞬时转染没有经过AID处理的初始CHO/dhFr-细胞，检测其与抗原的结合能力。
   

溶液配方

1. LB培养基
   10 g/L胰蛋白胨
   5 g/L酵母提取物
   5 g/L NaCl
2. 50 mg/ml卡那霉素
   将2.5 g卡那霉素溶于50 ml双蒸水 (ddH₂O)
3. 100 mM异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)
   1.2 g IPTG 溶于50 ml ddH₂O
4. 100 mM苯基甲磺酰氟 (PMSF)
   0.174 g PMSF溶于10 ml异丙醇中
5. 结合缓冲液
   500 mM NaCl
   20 mM Tris-Cl
   10%甘油
   5 mM咪唑
   pH 7.9
6. IMDM完全培养液
   用于培养CHO/dhFr-细胞，CHO-puro细胞和其他来于CHO/dhFr-细胞的细胞
   10% 胎牛血清
   0.1 mM次黄嘌呤
   0.016 mM胸苷
7. 100 mg/ml新霉素
   将1 g新霉素溶于50 ml无菌双蒸水中
   

致谢

相关工作得到中国科学院，北京市科委和国家自然科学基金的支持。本文实验方案改编自本实验室的发表文章 Chen等 (2012)，Chen等 (2016) 和An等 (2018)。

参考文献

1. An, L., Chen, C., Luo, R., Zhao, Y. and Hang, H. (2018). Activation-Induced Cytidine Deaminase Aided In Vitro Antibody Evolution. Methods Mol Biol 1707: 1-14.
2. Chen, C., Li, N., Zhao, Y. and Hang, H. (2016). Coupling recombinase-mediated cassette exchange with somatic hypermutation for antibody affinity maturation in CHO cells. Biotechnol Bioeng 113(1): 39-51.
3. Chen, S., Qiu, J., Chen, C., Liu, C., Liu, Y., An, L., Jia, J., Tang, J., Wu, L. and Hang, H. (2012). Affinity maturation of anti-TNF-alpha scFv with somatic hypermutation in non-B cells. Protein Cell 3(6): 460-469.