Improve Research Reproducibility A Bio-protocol resource

基于流式技术的哺乳动物细胞抗体进化平台的构建

Establishment of Mammalian Cell Platforms for Antibody Evolution Based on Flow Cytometry

安 安莉莉
陈 陈川
罗 罗蕊琪
赵 赵云
杭 杭海英

发表时间: 2019年11月20日 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010336 浏览次数: 5128

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流式细胞术实验手册
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摘要：活化诱导的胞嘧啶脱氨基酶 (activation induced deaminase，AID) 可引发B 细胞抗体基因的高频突变 (SHM)，是B细胞内抗体多样性产生的一个重要机制。研究发现，在细菌或非B细胞 (成纤维细胞，H1299细胞等) 中过表达AID，也可导致高表达基因产生高频的SHM样突变。基于AID基因这一作用特点，结合流式细胞分选技术的应用，研究者建立了哺乳动物细胞抗体展示与体细胞高频突变结合的抗体进化平台，用于抗体或蛋白的优化。为建立这一平台，我们实验室构建了一株CHO细胞克隆 (CHO-puro细胞)，该细胞株在染色体特定位点嵌入了单一的基因表达框，基因框外侧含有两个不同重组序列的DNA，便于快捷插入欲优化的抗体基因，且该位点使得插入的抗体基因能够高水平和稳定地表达。我们将以抗TNFα抗体的亲和力优化为例，详细介绍这一技术。首先，我们将TNFα抗体基因插入上面所述的CHO细胞克隆单一的基因表达框中，获得能够高水平且稳定展示TNFα抗体的CHO细胞株；然后，将AID表达质粒转入CHO细胞株，使TNFα抗体基因发生突变，随着细胞的增殖，自然形成突变抗体库；经过几轮的流式细胞分选-细胞增殖，可获得具有更高亲和力的抗TNFα抗体突变体。该技术可用于获得具有更高亲和力，特异性和稳定性的抗体，以及基于细胞表面展示和生物大分子相互作用的其他蛋白特性的优化。

Keywords: 活化诱导的胞嘧啶脱氨基酶 search 体细胞高频突变 search 抗体进化 search 亲和力成熟 search

材料与试剂

  1. 培养皿
  2. 0.45 μm滤膜
  3. 抗HA-PE抗体 (Abcam, catalog number: ab72564) 
  4. T4 DNA连接酶 (Thermo Scientific) 
  5. 异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)
  6. EcoRI
  7. XhoI
  8. 胎牛血清 (FCS, HyClone) 
  9. Anti-hFc (human Fc) kinetic grade biosensors (ForteBio, catalog number: 18-5060)
  10. 细胞：
    CHO/dhFr-细胞，购自上海中国科学院细胞库
    CHO-puro细胞，在染色体特定位点嵌入了单一的基因高表达框的CHO/dhFr-细胞，由杭海英实验室建立 (Chen等，2016)
    FreeStyleTM MAX 293F细胞，购自Invitrogen
  11. 质粒：
    PET28a (+) - GFP-TNFα，用于大肠杆菌中表达GFP-TNFα蛋白
    pF2AC，用于在CHO细胞中共表达Flpo和iCre重组酶的质粒
    pFAbL，用于将抗体 (TNFα抗体) 基因通过重组替换插入CHO-puro 细胞基因组单一的基因表达框中
    pCEP-Neo-mAID，用于在CHO细胞中表达mAID
    pCEP4-scFv-hFC，用于在FreeStyleTM MAX 293F细胞中表达scFv-hFc 融合蛋白
    以上为实验室已构建质粒，详细请参考实验室已发表文章 (Chen等，2012和2016)
  12. LipofectamineTM 2000 (Invitrogen) 
  13. 0.1 mM次黄嘌呤
  14. 0.016 mM胸苷 (HT, Gibco)
  15. PBS
  16. 异丙醇
  17. 胰蛋白胨
  18. 酵母提取物
  19. 卡那霉素
  20. 氯化钠
  21. 苯乙烯磺酰氟 (PMSF) 
  22. Tris-Cl
  23. 甘油
  24. 咪唑
  25. 新霉素
  26. Bradford蛋白质检测试剂盒 (Bio-Rad) 
  27. Ni Sepharose High Performance column (Amersham Biosciences) 
  28. 线性聚乙烯亚胺25,000 (PEI) (Polysciences) 
  29. Iscove’s Modified Dulbecco Medium (IMDM, HyClone)
  30. Free-StyleTM 293表达培养基 (Invitrogen) 
  31. Opti-MEM® I减血清培养基 (Gibco) 
  32. OptiPROTM SFM无血清培养基 (Gibco) 
  33. Wizard® SV Genomic DNA Purification System (Promega) 
  34. Phusion高保真PCR试剂盒 (NEB) 
  35. AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit (Axygen)
  36. LB培养基 (见溶液配方)
  37. 50 mg/ml卡那霉素 (见溶液配方)
  38. 100 mM异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) (见溶液配方)
  39. 100 mM苯基甲磺酰氟 (PMSF) (见溶液配方)
  40. 结合缓冲液 (见溶液配方)
  41. IMDM完全培养液 (见溶液配方)
  42. 100 mg/ml新霉素 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 超声仪 (南京鑫辰生物科技有限公司) 
  2. 恒温振荡培养箱 (HZQ-X100)
  3. Steri-Cycle CO2培养箱 (Thermo) 
  4. Shaker-Incubator Lab-Therm / LT-XC (Kuhner，瑞士) 
  5. FACSCalibur (BD) 
  6. FACSAriaTM IIIu (BD) 
  7. S1000TM 热循环仪 (Bio-Rad) 
  8. CHB-100恒温金属浴 (Bioer) 
  9. Nanodrop ND-1000分光光度计 (Thermo Scientific) 
  10. Octet生物分子相互作用技术平台 (ForteBio Octet, USA) 
  11. 离心机

实验步骤

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：安莉莉, 陈川, 罗蕊琪, 赵云, 杭海英. (2019). 基于流式技术的哺乳动物细胞抗体进化平台的构建. Bio-101: e1010336. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010336.
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How to cite: An, L. L., Chen, C., Luo, R. Q., Zhao, Y. and Hang, H. Y. (2019). Establishment of Mammalian Cell Platforms for Antibody Evolution Based on Flow Cytometry. Bio-101: e1010336. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010336.
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分类

细胞生物学 > 单细胞分析 > 流式细胞术

免疫学 > 抗体分析 > 抗体-抗原相互作用

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