自然杀伤细胞毒性测定   

研究背景：机体内常有一些受刺激或感染而产生的异常细胞，如肿瘤细胞、受感染的细胞。而固有免疫和适应性免疫能先后识别并清除这些异常细胞。其中NK细胞在固有免疫中发挥重要的作用。NK细胞可以迅速识别并杀伤非己或异常的细胞，其杀伤机制主要分为直接和间接的方式。直接杀伤包括Fas/FasL途径和TRAIL/DR5途径，而间接的杀伤方式包括分泌IFN-γ和颗粒酶、穿孔素等。NK细胞不同于T、B细胞，不表达TCR、BCR，但其胞质内富含嗜天青颗粒，激活后颗粒明显增多，这些颗粒与其杀伤活性有关，所以NK细胞的IFN-γ和其颗粒分泌能力的强弱可以间接反映出NK细胞杀伤功能的强弱。
        由于IFN-γ在胞内内质网合成、高尔基体加工后向外分泌，这将影响IFN-γ胞内染色检测的准确性，所以在共孵育1小时后需加入Brefeldin A和Monensin封闭高尔基体。孵育一段时间后，进行染色，即可流式检测。NK细胞中的细胞毒性颗粒主要存在于分泌性溶酶体，而CD107a又称溶酶体相关膜蛋白-1，是存在于溶酶体膜上的一种蛋白，当分泌性溶酶体分泌的过程中，溶酶体与细胞膜结合，CD107a随溶酶体膜与细胞膜结合而表达在细胞膜上，所以CD107a的表达程度与细胞脱颗粒程度正相关。
        相比于其他测细胞毒活性的方法，51Cr释放实验虽然之前很长一段时间内是检测细胞毒活性的黄金标准，但51Cr具有半衰期短、放射性等缺点，而LDH释放法具有敏感性低的缺点。而本实验具有安全、便捷、特异等特点，便于研究各基因、蛋白等对NK细胞细胞毒性的影响，发掘其中的机制。

材料与试剂

1. 镊子
2. 剪刀
3. 24孔板 (Costar) 
4. 60 mm x 15 mm平皿 (Corning, catalog number: 430166) 
5. 15毫升离心管 (BD Falcon, catalog number: 352096) 
6. 100目滤网
7. 注射器活塞
8. 血球计数板
9. 小鼠
10. 胎牛血清
11. CD107抗体 (eBioscience，catalog number: 50-1071, clone eBio1D4B, 1:100)
12. IFNγ抗体 (eBioscience, catalog number: 50-1071, clone XMG1.2, 1:200)
13. Poly I:C (InvivoGen, catalog number: 31852-29-6) 
14. PMA (Sigma-Aldrich, catalog number: P1585) 
15. Inomycin (Sigma-Aldrich, catalog number:407951) 
16. 红细胞裂解液 (eBioscience, catalog number: 00-4333-57) 
17. Brefeldin A Solution (1,000x) (eBioscience, catalog number: 00-4506-51) 
18. Monensin Solution (1,000x) (eBioscience, catalog number: 00-4505-51) 
19. PBS
20. PFA
21. 1640培养基 (WISENT, catalog number: 350-006-CL) 
22. 皂素 (Saponin, Sigma-Aldrich, catalog number: 47036) 
23. 洗液 (见溶液配方)
24. 细胞穿膜固定液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 二氧化碳培养箱
2. 多色流式细胞仪
3. 超净工作台
4. 离心机
   

实验步骤

1. 每只小鼠腹腔注射200 μl 1μg/μl的polyI:C。
2. 18小时后，处死小鼠，在超净台取小鼠脾脏，放于含100目筛网和3 ml PBS的60 mm x 15 mm平皿中用注射器活塞研磨，研磨至无明显组织块后收集细胞于15 ml离心管。
3. 400 x g 离心5 min。
4. 弃上清，加1 ml 1x红细胞裂解液，混匀，冰上裂解5 min。
5. 裂解完成后可见液体红色变淡，加5 ml PBS终止反应，400 x g 离心5 min。
6. 弃上清，1 ml PBS重悬细胞，100目滤网过滤并收集于1.5 ml EP管中。
7. 取20 μl细胞液到新的1.5 ml EP管并加入180 μl PBS，混匀，用血球计数板计数。
8. 调细胞浓度至 2 x 10⁶/250 μl (8 x 10⁶/ml)，24孔板，每孔加入250 μl细胞混悬液。
9. 收集提前培养好的RMA-S和YAC-1细胞，计数。
10. 调细胞浓度至 2 x 10⁶/250 μl (8 x 10⁶/ml)，每孔加入250 μl细胞混悬液至相应的孔中 (共500 μl)。
11. 同时每孔加入0.5 μl CD107抗体。
12. 设置空白对照孔 (+ 10% FBS 1640)，和阳性对照孔 (每孔加50 μl P + I混合液) 。
13. 共孵育1个小时后，加入Golgi block (每孔0.5 μl) (Brefeldin A Solution (1,000x)，Monensin Solution (1,000x)) 。
14. 培养箱中培养4小时。
15. 收集培养的细胞，PBS洗一次，加入100 μl (含2% FBS的PBS) 预先配好的流式抗体混合物对细胞表面分子进行染色。
16. 4 °C孵育1小时，中间混匀一次。
17. 加PBS，400 x g离心 5分钟，洗两次。
18. 弃上清，每管加入100 μl固定穿膜液，混匀，4 °C孵育1小时，中间混匀一次。
19. 每管加入500 μl洗液，混匀，1,700 x g 离心5分钟，洗两次。
20. 弃上清，每管加入100 μl IFNγ抗体 (洗液稀释)，4 °C孵育过夜。
21. 加洗液，混匀，1,700 x g 离心5分钟，洗两次。
22. 每管加入400 μl PBS，混匀，按照图1所示的画门策略，流式上机检测。
    

结果与分析

NK细胞与RMAS或者YAC-1肿瘤细胞共同培养后，可以检测到NK细胞产生了IFNγ和CD107a，NK细胞的IFN-γ和CD107a的水平反映了检测的NK细胞的杀伤活性 (图 2)。

图1. 流式检测画门策略

 
图2. 流式检测NK细胞胞内IFNγ和CD107a的水平

溶液配方

1. 洗液
   PBS
   0.1%皂素
   2% FBS
2. 细胞穿膜固定液 (1 L)
   4 g PFA
   0.1g皂素
   

致谢

董忠军实验室的工作得到清华大学免疫所的支持。本文实验方案改编自本实验室发表的文章 (Chen等，2016)。

参考文献

1. Chen, S., Yang, M., Du, J., Li, D., Li, Z., Cai, C., Ma, Y., Zhang, L., Tian, Z. and Dong, Z. (2016). The self-specific activation receptor SLAM family is critical for NK cell education. Immunity 45(2): 292-304.