摘要:NK细胞的主要功能是杀伤功能,但因许多因素而改变,如基因敲除、基因突变、激活剂、抑制剂等,均有可能影响NK细胞的功能,为了研究这些因素对NK细胞杀伤功能的影响,我们采用抗体标记NK的IFN-γ和CD107a的方法间接检测NK细胞的杀伤活性。本实验方法提前给小鼠腹腔注射polyI:C激活NK细胞,然后收集小鼠脾脏细胞与靶细胞 (RMAS、YAC-1细胞)共孵育,并设立阴性对照和阳性对照 (PMA + Inomycin),激活的NK细胞会发挥杀伤活性,上调IFN-γ的表达、增加颗粒酶的分泌。NK细胞的IFN-γ和其颗粒分泌能力的强弱可以间接反映出NK细胞杀伤功能的强弱。
关键词: NK细胞, 细胞毒性, 杀伤活性
研究背景:机体内常有一些受刺激或感染而产生的异常细胞,如肿瘤细胞、受感染的细胞。而固有免疫和适应性免疫能先后识别并清除这些异常细胞。其中NK细胞在固有免疫中发挥重要的作用。NK细胞可以迅速识别并杀伤非己或异常的细胞,其杀伤机制主要分为直接和间接的方式。直接杀伤包括Fas/FasL途径和TRAIL/DR5途径,而间接的杀伤方式包括分泌IFN-γ和颗粒酶、穿孔素等。NK细胞不同于T、B细胞,不表达TCR、BCR,但其胞质内富含嗜天青颗粒,激活后颗粒明显增多,这些颗粒与其杀伤活性有关,所以NK细胞的IFN-γ和其颗粒分泌能力的强弱可以间接反映出NK细胞杀伤功能的强弱。 由于IFN-γ在胞内内质网合成、高尔基体加工后向外分泌,这将影响IFN-γ胞内染色检测的准确性,所以在共孵育1小时后需加入Brefeldin A和Monensin封闭高尔基体。孵育一段时间后,进行染色,即可流式检测。NK细胞中的细胞毒性颗粒主要存在于分泌性溶酶体,而CD107a又称溶酶体相关膜蛋白-1,是存在于溶酶体膜上的一种蛋白,当分泌性溶酶体分泌的过程中,溶酶体与细胞膜结合,CD107a随溶酶体膜与细胞膜结合而表达在细胞膜上,所以CD107a的表达程度与细胞脱颗粒程度正相关。 相比于其他测细胞毒活性的方法,51Cr释放实验虽然之前很长一段时间内是检测细胞毒活性的黄金标准,但51Cr具有半衰期短、放射性等缺点,而LDH释放法具有敏感性低的缺点。而本实验具有安全、便捷、特异等特点,便于研究各基因、蛋白等对NK细胞细胞毒性的影响,发掘其中的机制。
材料与试剂
仪器设备
实验步骤
结果与分析
NK细胞与RMAS或者YAC-1肿瘤细胞共同培养后,可以检测到NK细胞产生了IFNγ和CD107a,NK细胞的IFN-γ和CD107a的水平反映了检测的NK细胞的杀伤活性 (图 2)。
图1. 流式检测画门策略 图2. 流式检测NK细胞胞内IFNγ和CD107a的水平
溶液配方
致谢
董忠军实验室的工作得到清华大学免疫所的支持。本文实验方案改编自本实验室发表的文章 (Chen等,2016)。
参考文献
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