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酵母流式细胞荧光分选流程   

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摘要:酵母文库筛选技术是蛋白质或多肽定向进化研究中的一个重要手段。利用荧光蛋白报告基因,荧光流式分选技术可以将高表达融合蛋白的突变体进行分离,通过鉴定后获得序列进行重组表达。此外,还可以在酵母表面展示功能蛋白质,如纳米抗体 (单域抗体) 等。当纳米抗体结合带荧光标记的目的蛋白后,荧光流式分选技术同样可以将表达有亲和力高的纳米抗体的酵母进行分离鉴定,从而达到抗体的定向进化。本文以绿色荧光蛋白 (GFP) 的纳米抗体筛选为例,介绍流式检测及分选技术在酵母文库筛选中的应用。

关键词: 酵母文库, 纳米抗体筛选, 流式检测及分选


研究背景:
本文的酵母展示文库是一个合成库 (非免疫库),可针对任何靶蛋白进行筛选(Cherf和Cochran,2015;McMahon等,2018),其设计如图1所示。首先,所有的纳米抗体的C端融合了一个HA标签,在与荧光标记的HA抗体孵育的情况下,可用于检测酵母细胞中纳米抗体的表达情况。而HA标签C端则融合一个长铰链区连接到酵母细胞表面实现有效的展示(McMahon等,2018)。其次,展示库中含有约5 × 108种纳米抗体序列,其区别在于3个可变区的氨基酸序列(McMahon等,2018)。在实际操作中,因为文库数量巨大,一般先采用磁珠分选的方法对能结合靶蛋白的酵母进行富集,然后再采用更精确的荧光流式分选进行进一步富集(Schutz等,2016;McMahon等,2018)。流式荧光分选时,荧光信号一般来自于靶蛋白质上的化学标记,如对赖氨酸进行特异标记的带有N-羟基琥珀酰亚胺酯修饰的Alexa Fluor 647或fluorescein isothiocyanate (FITC) 等染料。为了方便描述,本文采用GFP作为靶蛋白,省略了荧光标记步骤。


图 1. 纳米抗体展示库示意图. 纳米抗体的C端融合了一个HA标签,再通过一个铰链区结合到酵母细胞壁上实现展示 (McMahon等,2018)。

材料与试剂

  1. 孔径为0.22 μm的滤膜 (Tansoole, catalog number: 02026463)
  2. 孔径为40 μm的滤网 (Falcon, catalog number: 352340 )
  3. 底部透明的96孔板 (Nunc, catalog number: 8494)
  4. 细胞培养板24孔 (洁特,catalog number: TCP000024(EFU225))
  5. HA小鼠源抗体 (Sigma-Aldrich, catalog number: H3663-200 μl)
  6. Cy3标记的山羊抗小鼠二抗 (Jackson, catalog number: 115-165-166)
  7. 牛血清白蛋白 (Aladdin, catalog number: A104912-100G)
  8. 纳米抗体酵母表面展示库 (哈佛大学Andrew Kruse教授组构建)
  9. 色氨酸缺陷的氨基酸混合物 (Sigma-Aldrich, catalog number: Y1876)
  10. 酵母基础氮源 (BD, catalog number: 291930-10 KG)
  11. 柠檬酸钠 (Aladdin, catalog number: S116315-1KG)
  12. 柠檬酸 (Sigma-Aldrich, catalog number: C2404-500G)
  13. 葡萄糖 (国药,catalog number: 14431-43-7)
  14. 链霉素青霉素 (美仑生物,catalog number: MA0110)
  15. 半乳糖 (Ameresco, catalog number: 0637-500G)
  16. HEPES (Ameresco, catalog number: 0511-1KG)
  17. 氯化钠 (Ameresco, catalog number: 0241-10KG)
  18. 麦芽糖 (Sigma-Aldrich, catalog number: M5885-100G)
  19. 琼脂粉 (国药,catalog number: 10000561)
  20. 氢氧化钠
  21. Yglc4.5-Trp培养基 (见溶液配方)
  22. Ygal4.5-Trp培养基 (见溶液配方)
  23. Yglc4.5-Trp平板 (见溶液配方)
  24. 缓冲液A (见溶液配方)
  25. HEPES/Na (见溶液配方)

仪器设备

  1. 摇床 (知楚,model: ZQZY-C)
  2. 酶标仪 (Spectra Max, model: M2)
  3. 旋转培养器 (Kylin-Bell lab instruments, model: QB-128)
  4. 离心机 (Eppendorf, model: 5424R)
  5. 流式细胞仪 (BD, model: LSRFortessa; Beckman, model: Beckman Coulter Moflo-XDP)
  6. 超低温冰箱 (Eppendorf, model: CryoCube F570)
  7. 水浴锅 (精宏,model: XMTD-8222 )
  8. 培养箱 (上海博迅,model: SPX-100B-Z)
  9. 高压灭菌锅

实验步骤

  1. 酵母细胞培养及纳米抗体诱导表达
    1.1
    酵母表面展示库复苏:将构建好的酵母表面展示库 (5 × 109个细胞) 从-80 °C中取出,在30 °C水浴中迅速化开细胞后转接到250 ml Yglc4.5-Trp培养基中,在30 °C摇床中250 rpm震荡培养24 h。
    1.2
    酵母表面展示库诱导:取细胞培养液,用单蒸水稀释10倍,加入340 μl稀释液到96孔板中,在酶标仪中测定细胞的OD600值。根据测定的OD600值,用Ygal4.5-Trp培养基将细胞稀释到OD600值为0.6,在25 °C摇床中250 rpm震荡培养17 h,诱导蛋白表达。
  2. 流式检测细胞表面纳米抗体表达
    2.1
    测定诱导后细胞的密度:在96孔板中用酶标仪测定细胞的OD600值,根据OD600值计算细胞密度 (注意事项1)。
    2.2
    清洗细胞:从诱导的细胞中取两份约1 × 106个细胞到含有0.8 ml缓冲液A的1.5 ml离心管中。3,000 × g, 4 °C离心1 min,弃上清。
    2.3
    一抗标记细胞:按1:5,000比例将HA抗体稀释到缓冲液A中,用0.5 ml稀释好的抗体重悬其中一份细胞,作为实验组。用0.5 ml缓冲液A重悬另一份细胞,作为对照组。在4 °C旋转培养1 h。
    2.4
    清洗细胞:3,000 × g,4 °C离心1 min,弃上清。用1 ml缓冲液A重悬细胞,3,000 × g,4 °C离心1 min,弃上清。
    2.5
    荧光二抗标记细胞:按1:500比例将Cy3标记的山羊抗小鼠的二抗稀释到缓冲液A中,用0.5 ml稀释后的抗体重悬对照组细胞和实验组细胞 (注意事项3)。在4 °C避光旋转培养1 h。
    2.6
    清洗细胞:3,000 × g,4 °C离心1 min,弃上清。用1 ml缓冲液A重悬细胞,3,000 × g,4 °C离心1 min,弃上清。
    2.7
    流式检测蛋白表达:用0.5 ml缓冲液A重悬细胞,用40 μm滤网过滤细胞后,流式细胞仪检测蛋白的表达。根据Cy3的荧光信号选择PE561通道进行检测,具体流式检测的方法参见流式细胞仪的操作说明。
  3. 流式分选能结合GFP的酵母细胞群
    3.1
    清洗细胞:将经过两轮磁珠分选而富集带有能结合GFP蛋白的纳米抗体的酵母细胞复苏后,按照上述步骤1和2进行诱导和表达检测。从诱导的细胞中取两份约3 × 107个细胞到含有0.8 ml缓冲液A的1.5 ml离心管中。3,000 × g,4 °C离心1 min,弃上清。
    3.2
    靶蛋白GFP与酵母细胞孵育:用0.5 ml缓冲液A重悬两份细胞,在其中一份细胞中加入1μM (30 mg L-1) 纯化的GFP蛋白,作为实验组,另一份细胞中不加GFP蛋白,作为阴性对照组。在4 °C旋转培养1 h。
    3.3
    清洗细胞:3,000 × g,4 °C离心1 min,弃上清 。用1 ml缓冲液A重悬细胞,3,000 × g,4 °C离心1 min,弃上清。
    3.4
    流式分选细胞:用0.5 ml缓冲液A重悬细胞,用40 μm滤网过滤细胞后,进行流式分选。根据GFP的荧光信号选择FITC通道,分选FITC阳性的细胞群。流式分选过程参见流式细胞仪的操作手册。
  4. 流式检测筛选能结合GFP的单克隆酵母
    4.1
    分离单克隆:取出部分分选后的细胞均匀涂布到Yglc4.5-Trp平板上,30 °C培养两天。
    4.2
    单克隆酵母培养诱导:挑取单克隆到0.7 ml Yglc4.5-Trp培养基中,在30 °C摇床中180 rpm震荡培养24 h。测定细胞OD600值,用Ygal4.5-Trp培养基稀释细胞,使得OD600最终为0.6,在25 °C摇床中180 rpm震荡培养17 h,诱导蛋白表达。
    4.3
    流式检测筛选结合GFP的单克隆:取1 × 106个诱导后的细胞到含有0.8 ml缓冲液A的1.5 ml离心管中。3,000 × g,4 °C离心1 min,弃上清。用含有1 μM GFP的缓冲液A重悬细胞,并设置一个不加GFP的阴性对照组,在4 °C旋转培养1 h后,3,000 × g,4 °C离心1 min,弃上清。用1 ml缓冲液A清洗细胞一次后,用0.5 ml缓冲液A重悬细胞。用40 μm滤网过滤细胞后,流式细胞仪检测FITC通路信号。筛选FITC阳性的克隆,即很有可能是能够结合GFP的克隆。

结果与分析

  1. 酵母表面展示库的诱导表达检测
    在进行纳米抗体筛选之前,首先要确定的是纳米抗体在酵母细胞中的表达。图2展示的是一个典型的纳米抗体表达检测的结果。比较实验组和对照组的流式分选结果可以发现,诱导后的细胞有一群荧光较高的细胞。通过软件分析计数发现这一群细胞占所有细胞数目的32.3 %,即在检测的细胞中,32.3 %的细胞表达了纳米抗体。


    图2. 流式检测酵母细胞表面展示蛋白的表达. 利用抗原抗体的特异性结合,通过检测Cy3信号 (PE561通道) 来检测目的蛋白的表达。红线是未标记抗体的对照组,蓝线是标记抗体的实验组,Nb是纳米抗体的简称。

  2. 基于流式检测的克隆筛选
    在分选出来的细胞中,不同细胞表面的纳米抗体与GFP的结合特异性和亲和力不同,我们希望能够筛选到高亲和力的克隆。因此,在分选结束后,我们需要再利用流式检测筛选单克隆。如果细胞能够结合更多的GFP分子,细胞的绿色荧光信号更强,那么在流式检测中使用的FITC的荧光通路信号会越强,最终筛选FITC信号强的克隆,再进行下游的生化实验验证筛选的结果。典型的实验结果如图3 所示。


    图 3. 基于流式检测的克隆筛选. 利用GFP的荧光信号,通过检测FITC信号来筛选结合GFP的克隆。图中阴性对照是没有加GFP的细胞,FITC信号强度低。Colony 1-5是筛选的单克隆,诱导后与GFP孵育的样品,检测发现不同克隆之间FITC信号差异比较大,其中Colony 1的FITC信号强度高于其他克隆,可能是一个结合GFP比较强的克隆。

注意事项

  1. 细胞密度计算
    根据校准,当细胞OD600值为1时,细胞的密度为1.5 × 107个/ml。则:细胞密度= OD600 × 稀释倍数 × (1.5 × 107)个/ml。
  2. 在缓冲液A中根据特定蛋白的特定需求可以加入配体等添加物。缓冲液A中的麦芽糖可以提高酵母分选后细胞的存活率。
  3. 用含有Cy3二抗的缓冲液重悬对照组细胞,可以排除能够被Cy3染色的假阳性酵母细胞。

溶液配方

  1. Yglc4.5-Trp培养基 (1 L)
    1.92 g色氨酸缺陷的氨基酸混合物
    6.7 g酵母基础氮源
    11.86 g柠檬酸钠
    6.76 g柠檬酸
    22 g葡萄糖
    10 ml链霉素青霉酸
    调节pH到4.5
    用单蒸水定容到1 L,用0.22 μm滤膜过滤除菌,保存在4 °C
  2. Ygal4.5-Trp培养基 (1 L)
    1.92 g色氨酸缺陷的氨基酸混合物
    6.7 g酵母基础氮源
    11.86 g柠檬酸钠
    6.76 g柠檬酸
    22 g半乳糖
    10 ml链霉素青霉酸
    调节pH到4.5
    用单蒸水定容到1 L,用0.22 μm滤膜过滤除菌,保存在4 °C
  3. Yglc4.5-Trp平板 (1 L)
    称取20 g琼脂粉,加入500 ml单蒸水,高压灭菌
    1.92 g色氨酸缺陷的氨基酸混合物
    6.7 g酵母基础氮源
    11.86 g柠檬酸钠
    6.76 g柠檬酸
    22 g葡萄糖
    10 ml链霉素青霉酸
    调节pH到4.5,用单蒸水定容到500 ml
    用0.22 μm滤膜过滤除菌,加入到高压灭菌的琼脂粉中,制备平板
  4. 缓冲液A
    20 mM HEPES/Na pH 7.5
    150 mM氯化钠
    0.1% (w/v)牛血清白蛋白
    5 mM麦芽糖
  5. 1 M HEPES/Na
    称取11.9 g HEPES
    加入30 ml Milli Q水
    溶解后用氢氧化钠调节pH至7.5
    定容至50 ml
    用0.22 μm滤膜过滤除菌,室温下保存

致谢

感谢哈佛大学Andrew Kruse教授提供纳米抗体酵母展示库。

参考文献

  1. Cherf, G. M. and Cochran, J. R. (2015). Applications of Yeast Surface Display for Protein Engineering. Methods Mol Biol 1319: 155-175.
  2. McMahon, C., Baier, A. S., Pascolutti, R., Wegrecki, M., Zheng, S., Ong, J. X., Erlandson, S. C., Hilger, D., Rasmussen, S. G. F., Ring, A. M., Manglik, A. and Kruse, A. C. (2018). Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nat Struct Mol Biol 25(3): 289-296.
  3. Schutz, M., Schoppe, J., Sedlak, E., Hillenbrand, M., Nagy-Davidescu, G., Ehrenmann, J., Klenk, C., Egloff, P., Kummer, L. and Pluckthun, A. (2016). Directed evolution of G protein-coupled receptors in yeast for higher functional production in eukaryotic expression hosts. Sci Rep 6: 21508.
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Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:李婷婷, 李典范. (2019). 酵母流式细胞荧光分选流程. Bio-101: e1010332. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010332.
How to cite: Li, T. T. and Li, D. F. (2019). Fluorescence Activated Cell Sorting of Yeast Cells Using Flow Cytometry. Bio-101: e1010332. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010332.
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