摘要:人外周血是最容易获取的人体样本,在医学类科研工作中至关重要。如何最大化、最高效地观察和利用有限的人外周血标本,通过一次实验检测得到更多的结果指标,对现有的实验研究意义重大。因此本文主要描述如何进行25色流式检测及介绍相关分析方法,通过对单个细胞同时检测25个参数,可以实现对外周血各种免疫细胞亚群的全景式描述,以及对某种细胞亚群的深度表型分析。
关键词: 人外周血, 亚群分类, 25色流式分析
材料与试剂
材料:
仪器设备
实验步骤
一. 人外周血免疫细胞的制备 (Gupta等,2013)
25色流式染色和正常流式染色步骤一致,本实验研究的25色全景分析所用的抗体均为表面抗体,因此只需要进行常规流式表面染色。
得到流式结果后,需要使用正版flowjo V10软件对结果进行全面分析 (视频2)。
视频2. 各类淋巴细胞圈门过程
结果与分析
本实验先根据细胞大小和包含的颗粒度,即FSC和SSC,将人外周血免疫细胞主要分成淋巴细胞群和单核细胞群等。然后,我们观察了CD3、CD19的表达情况,其中CD3+为T细胞群,占白细胞64.6%,CD19+为B细胞群,占白细胞8.45%。细分T细胞,通过CD4和CD8,可以将T细胞分为辅助T细胞和杀伤性T细胞,两者分别占T细胞的64%和30%。对于辅助T细胞,我们还检测了其中一个亚群Treg的比例,其约占辅助T细胞的7.85%。CD3+CD56+的细胞群为NKT细胞,大约占T细胞的5.72%。细分B细胞,IgD+的naïve B细胞约占总B细胞的52.1%,CD27+的记忆B细胞约占总B细胞的27%。
图7. 人外周血免疫细胞亚群分类. 根据文献报道的不同免疫细胞亚群的定义,在本次实验中主要划分了T细胞 (CD3+)、B细胞 (CD19+)、NKT细胞 (CD3+CD56+)、NK细胞(CD3-CD19-CD16+CD56+)、DC(CD3-CD19-CD56-HLA DR+)、单核细胞(CD3-CD19-CD14+)等不同免疫细胞亚群。
CD3-CD19-的双阴性细胞群既包含淋巴细胞群又包含单核细胞群。因此根据CD14的表达情况和细胞内颗粒度 (SSC),可将细胞群划分为CD14+单核细胞群和CD14-淋巴细胞群。细分CD14-CD3-CD19-淋巴细胞群,其中CD56+为NK细胞,约有84.9%的细胞高表达CD94,用于识别MHC I。而CD56-为DC细胞群,其中约有52.3%表达HLA-DR。存在的问题是,本次实验关于单核细胞群的分类并不明显,猜测是本次样品粒细胞群不明显的问题。通过25色大panel,我们可以最大程度一次性观察所有人外周血免疫细胞亚群并得到相应的细胞比例。
图8. 人外周血免疫细胞群的t-SNE分析. 取7万个免疫细胞进行t-SNE分析,分析参数为补偿后的25个maker。A. 流式圈门后的不同细胞群显示t-SNE界面并合并在一起得到细胞群降维后的分布形态。B. 在t-SNE分布图上根据每个细胞CD45RA的表达情况 (即平均荧光强度) 做的热图,红色代表CD45RA表达高,蓝色代表表达低。
t-SNE全称t-distributed stochastic neighbor embedding,可将多维参数经迭代计算后在二维坐标轴上进行展示。通过计算,t-SNE分布图由多个散点组成,每个散点代表一个细胞,两个散点之间的距离代表着两个细胞的相似程度。距离越近,则相似程度越高。另外,在正版flowjo V10版本中,还可以观察t-SNE heatmap,即在t-SNE坐标轴中展示某一个参数的表达水平。在图8A中,最明显的比例最高的红色细胞群为辅助T细胞,粉色的Treg细胞群位于其中,这与Treg属于辅助T细胞这一常识相一致,说明本次t-SNE分析可信。由于NKT细胞表达CD4或CD8,因此一部分NKT亚群靠近辅助T细胞,一部分NKT靠近杀伤性T细胞,因而紫色的NKT细胞表现出很高的异质性。因为t-SNE是综合25个参数进行的分析,所以我们可以发现不同淋巴细胞内部的异质性。图8B中T细胞的异质性主要体现在CD45RA的表达上,由于不同的T细胞关于CD45RA的表达不一致,从而出现明显的亚群分类。另外,加入其它有意义的maker,有助于发现新的细胞亚群。
失败经验
溶液配方
致谢
感谢沈蕾实验室各位研究生同学对本实验方法的帮助和改进。本实验得到国家自然科学基金项目 (81571533) 的资助。
参考文献
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