应用流式细胞技术分选小鼠各级精母细胞的方法   

材料与试剂

1. CO₂安乐死箱
2. 剪刀
3. 镊子
4. 培养皿
5. 5 ml塑料滴管，15 ml离心管，50 ml离心管，5 ml流式管
6. 雄性小鼠 (C57/BL6，3周龄及以上)
7. 胎牛血清 (FBS)
8. 常规驴血清 (Jackson ImmunoResearch, catalog number: 017-000-121)
9. 一抗：兔抗SYCP3 (Abcam，catalog number: ab15093，稀释比1:500)，鼠抗γH2AX (Millipore, catalog number: 050636，稀释比1:1000)
10. 荧光二抗：Alexa Fluor 488抗鼠IgG；Alexa Fluor 594 抗兔IgG
11. DMEM (Hyclone, catalog number: SH30243.01)
12. 0.25%胰酶 (Gibco, catalog number: 25200072)
13. I型胶原酶 (Worthington, catalog number: LS004196)
14. DNase I (Sigma-Aldrich, catalog number: DN25)
15. Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, catalog number:14533)
16. 磷酸盐缓冲液 (1x PBS)
17. 碘化丙啶 (PI) (碧云天， catalog number: ST511)
18. Triton X-100 (Sigma-Aldrich, catalog number: T8757-500ML)
19. 柠檬酸钠 (Sigma-Aldrich, catalog number: S1804-500G)
20. EDTA (沪试, catalog number: 10009617)
21. 蔗糖 (沪试, catalog number: 10021418)
22. NaOH (上海实验试剂有限公司, 174320)
23. PMSF (Sigma-Aldrich, catalog number: 78830)
24. DTT (Sigma-Aldrich, catalog number: 43815)
25. Tris (AMRESCO, catalog number: 0497-500G)
26. PFA (AMRESCO, catalog number: J531-500G)
27. Tris-HCl
28. 硼酸
29. I型胶原酶溶液 (见溶液配方)
30. DNase I溶液 (见溶液配方)
31. Hoechst 33342溶液 (见溶液配方)
32. 碘化丙啶 (PI) 溶液 (见溶液配方)
33. 低渗液 (见溶液配方)
34. 1% PFA (见溶液配方)
35. 封闭液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 杂交炉 (UVP Hybrilinker Oven)
2. 流式细胞仪 (BD, model: Aria-II)
3. 荧光显微镜 (Zeiss，model: Axio Scope.A1)
4. 水浴锅
   

实验步骤

一． 睾丸组织的消化

1. 于32 °C杂交炉中预热PBS、胶原酶和0.25%胰酶。
2. 将小鼠经CO₂安乐死，取其双侧睾丸，置于含预冷PBS的6孔板中。
3. 剥除睾丸被膜，并将生精小管充分扯散，每侧睾丸分别置于含5 ml预热胶原酶的15 ml离心管中，于32 °C杂交炉中以120 rpm的转速消化10分钟，此时生精小管变得细而透明。
4. 室温静置1分钟，吸出4 ml上清于新的离心管中并置于冰上，原离心管中保留睾丸组织和1 ml胶原酶。
5. 往原离心管中加入4 ml预热的PBS、5 ml预热的胰酶以及100 µl DNase I，于32 °C杂交炉中以120 rpm的转速消化8分钟，在消化至5分钟时，用塑料滴管吹打组织30次左右，帮助组织更充分地与胰酶接触。
   注：吹打的步骤切忌用枪头，避免其剪切力过高对细胞造成损害；胰酶消化后液体变得浑浊，无大的组织团块，可见细碎的管状组织，并常伴有少许透明胶状物 (即破碎的细胞释放出的DNA)。若管状物过多，则表示消化的不充分，若透明胶状物过多，则表明消化过度。本步骤是决定细胞状态的关键一步，初学者需通过不断取样镜检，观察组织的消化状态、细胞的活率等而确定消化的最佳条件。
6. 加入0.5 ml FBS终止消化，加入100 µl DNase I，用塑料滴管轻轻吹打30次左右，将细胞悬液及第4步的上清液经70 µm滤网过滤到50 ml离心管中。
7. 计数，一只成年小鼠两侧睾丸可获得约5~8 x 10⁷细胞，500 x g离心4分钟。
   
   

二． Hoechst染色

1. 根据计数结果，用DMEM将细胞重悬成10⁶细胞/ml，加入10 µl DNase I，并按照5 µg/10⁶细胞的量加入Hoechst。
   注：重悬时先加1 ml DMEM和10 µl DNase I，轻弹使沉淀重悬，再加DMEM将悬液稀释成10⁶细胞/ml。
2. 32 °C杂交炉中以60 rpm的转速染色30分钟。
3. 500 x g离心4分钟。去上清，用含2% FBS、10 µg/ml DNase I的DMEM重悬，细胞浓度控制在10⁷/ml。
   
   

三． 流式分选

1. 在即将上机时，向细胞悬液中加入PI (1 µg/10⁶细胞)，用40 µm滤网过滤至流式管中。
2. 样品上机，流速控制在6,000细胞/秒以内，预展示50,000 个细胞，在工作表中画实验所需模板：先以二维散点图FSC-A/SSC-A展示细胞大小，以P1门圈选主细胞群体 (图1A)。随后以二维散点图FSC-H/FSC-W和SSC-H/SSC-W去除粘连细胞 (图1B~C)。紧接着通过PE-Texas Red-A检测PI信号，去除PI阳性的死细胞 (图1D)。最后，保留的PI阴性细胞通过二维散点图Indo (Blue)-A/DAPI-A展示细胞大小及细胞的核型，用不同的门圈选不同阶段的生精细胞 (图1E)。细胞群体的层次关系及所占比例等参考图1F。
   注：图1E中的细胞群体的划分主要根据细胞的核型及细胞大小：细线前期精母细胞 (P5) 为精母细胞的S期，故其核型应介于二倍体与四倍体之间；细线期、偶线期、粗线期、双线期均为四倍体，但是其在细胞大小上能够区分开，其中细线期/偶线期细胞 (P6) 相对较小，当转变为粗线期细胞 (P7) 时，细胞尺寸逐渐变大，双线期细胞 (P8) 尺寸最大。减数第一次分裂完成后形成的次级精母细胞 (P9) 为二倍体，减数第二次分裂完成后形成的圆形精子 (P10) 为单倍体。
3. 接收管内加入含2% FBS的DMEM作为接收液，将感兴趣的细胞群体收集到接收管中。所得细胞镜检、计数、验证、离心收集，即可用于其他下游实验。
   
   
   图1. 流式分选小鼠精母细胞的设门策略
   
   

四． 细胞类型验证

1. 分选后的各级精母细胞分别取50 µl置于1.5 ml离心管中，向其中加入50 µl低渗液 (配制方法参考溶液配方)，混匀，于室温低渗10分钟；
2. 500 x g室温离心4分钟，去上清；
3. 加入10 µl 100 mM的蔗糖溶液，重悬细胞；
4. 玻片上滴加40 µl 1%PFA溶液 (配制方法参考溶液配方)，涂抹均匀，立即将10 µl细胞悬液滴加至玻片上，并置于留有些许缝隙的湿盒中。约2小时后，玻片即可晾干，用于免疫荧光染色；
5. 上述精母细胞铺片用PBST (含0.1%Triton X-100的PBS) 洗涤10分钟，室温封闭1小时 (封闭液配制方法参考溶液配方)，以封闭液稀释一抗，于4 °C孵育过夜；
6. PBST洗涤3次，每次10分钟，以封闭液稀释二抗，于室温孵育1小时；
7. PBST洗涤3次，每次10分钟，封片；
8. 荧光显微镜观察。
   

结果与分析

流式分选所得各级精母细胞通过核铺展结合免疫荧光染色验证细胞类型。细胞铺片以SYCP3 (联会复合体侧轴组分的标志物) 和γH2AX (指示DNA双链断裂的信号) 抗体共染免疫荧光，对所收细胞的纯度进行鉴定。细线前期精母细胞尚未发生联会复合体的组装及DNA双链断裂，其SYCP3信号呈斑块状分布，γH2AX染色弱阳性；细线期精母细胞发生联会复合体侧轴组分的组装以及DNA双链断裂，其SYCP3呈不连续的线状信号，γH2AX信号逐步积累并弥散于整个核；偶线期精母细胞阶段联会复合体侧轴组分已组装完全，发生同源染色体的联会及DNA双链断裂的修复，可见SYCP3信号为连续的线状并有不同程度的联会现象，γH2AX信号随着DNA双链断裂的修复也逐渐减少；粗线期精母细胞同源染色体完全联会，常染色体上的DNA双链断裂均已修复，SYCP3呈短棒状信号，γH2AX信号只存在于性染色体上；双线期发生同源染色体的解联会，通过SYCP3信号可观察到不同程度的解联会现象，γH2AX信号只存在于性染色体上。免疫荧光结果显示，各个阶段细胞的纯度均在70%以上，污染主要来自于相邻阶段细胞的混入 (图2A~E)。由于门的设定直接影响细胞的纯度，若对纯度有更高要求，可缩小圈选的范围。


图2. 流式分选后各级精母细胞的验证. 将流式分选的不同群体细胞进行核铺展，并结合免疫荧光进行验证。其中P5群体富集了细线前期精母细胞(A)，P6群体富集了细/偶线期精母细胞(B)，P7群体富集了粗线期精母细胞(C)，P8群体富集了双线期精母细胞(D)，标尺=100 µm。通过统计得出纯度结果(E)。

失败经验

消化所得细胞过少：

1. 消化不充分，未充分消化的组织团块在过滤时被丢弃。
   注：消化过程中应随时取样镜检，观察消化状态。在胰酶消化时中间需用塑料滴管吹打，帮助组织与胰酶充分接触。
2. 消化过度，细胞破碎。
   注：消化过程中应随时取样镜检，消化至理想状态时应立即加FBS终止消化。
3. 胰酶消化后未加足够量的DNase I。
   注：消化时会不可避免地造成少量细胞破碎，其释放出的DNA会聚集产生透明胶状物，过滤时会堵塞滤网。胰酶消化后应加DNase I并吹打至透明胶状物消失。
   
   

流式分选时细胞碎片过多或PI阳性细胞过多：

1. 消化过度或消化后的细胞未妥善保存。
   注：消化过程中应随时取样镜检，消化至理想状态时应立即加FBS终止消化。消化并染色后的细胞在重悬时应用含2% FBS的DMEM重悬，置于冰上，并尽快上机分选。
2. PI加的过早或用量过大。
   注：PI是有细胞毒性的染料，应在即将上机时再加入，并应严格控制用量。
   
   

分选后细胞得率低：

1. 机器状态问题。
   注：检查流式细胞仪液流的稳定性、drop delay参数及分选电压等。
2. 接收液问题。
   注：接收管中应加1 ml左右的接收液，一般用含2% FBS的DMEM作为接收液。
   
   

分选后细胞纯度低：

1. 通常与门的设置有关。
   注：根据纯度鉴定结果调整门的位置。
   

溶液配方

1. I型胶原酶溶液
   I型胶原酶粉末用PBS溶解成120 U/ml
   4 °C可短期保存，分装后冻存于-20 °C
2. DNase I溶液
   DNase I粉末用PBS溶解成5 mg/ml
   4 °C可短期保存，分装后冻存于-20 °C
3. Hoechst 33342溶液
   Hoechst 33342粉末用ddH₂O溶解成10 mg/ml
   4 °C保存
4. 碘化丙啶 (PI) 溶液
   碘化丙啶粉末用ddH₂O溶解成10 mg/ml
   4 °C保存
5. 低渗液
   
   1)

   30 mM Tris-HCl (pH8.2), 50 mM 蔗糖，17 mM 柠檬酸钠，5 mM EDTA，用50 mM硼酸调pH至8.2~8.4
   2)

   使用前加入终浓度为2.5 mM的DTT和0.5 mM的PMSF
6. 1% PFA
   
   1)

   称取0.25 g PFA置于50 ml离心管中，加入22.5 ml ddH₂O
   2)

   向其中滴加1滴1 M的NaOH助溶，于60 °C水浴20分钟以上，其间颠倒混匀数次，至PFA完全溶解
   3)

   溶解后的PFA冷却至室温，用50 mM硼酸调pH至9.2~9.4，加入50 µl Triton X-100，振荡，补足体积至25 ml
7. 封闭液
   常规驴血清用PBST (含0.1% TritonX-100的PBS) 稀释至10%
   

致谢

本项目得到中国科学院战略性先导科技专项 (XDB19000000)，国家重点研发计划(2018YFC1003401和2016YFC1000605)，国家自然科学基金 (31671553)，上海市科学与技术委员会基金 (17JC1420102) 以及中科院生化与细胞所基金的支持。感谢中科院生化与细胞所细胞分析技术平台、动物实验技术平台提供的技术与设施服务。本文的实验方案是在之前已发表文章 (Gaysinskaya等，2014) 的基础上改进的，已用于本实验室发表的文章 (Lin等，2017) 和 (Chen等，2018) 中。

参考文献

1. Chen, Y., Zheng, Y., Gao, Y., Lin, Z., Yang, S., Wang, T., Wang, Q., Xie, N., Hua, R., Liu, M., Sha, J., Griswold, M. D., Li, J., Tang, F. and Tong, M. H. (2018). Single-cell RNA-seq uncovers dynamic processes and critical regulators in mouse spermatogenesis. Cell Res 28(9): 879-896.
2. Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W. and Bortvin, A. (2014). Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A 85(6): 556-565.
3. Lin, Z., Hsu, P. J., Xing, X., Fang, J., Lu, Z., Zou, Q., Zhang, K. J., Zhang, X., Zhou, Y., Zhang, T., Zhang, Y., Song, W., Jia, G., Yang, X., He, C. and Tong, M. H. (2017). Mettl3-/Mettl14-mediated mRNA N⁶-methyladenosine modulates murine spermatogenesis. Cell Res 27(10): 1216-1230.