摘要:减数分裂是生物有性生殖的基础,其过程高度复杂且受到严密调控。减数分裂细胞周期可分为I期 (MI,减数第一次分裂) 和II期 (MII,减数第二次分裂),而MI和MII又可各自划分为前期、中期、后期和末期。其中,MI前期的生物学事件尤为复杂,同源染色体的配对、联会和重组交换均发生在该时期。根据染色质形态,MI前期通常又被划分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。高效地分选减数分裂时期尤其是MI前期各阶段的精母细胞是深入探索减数分裂调控机制的基础。本方案以小鼠为例,提供一种应用流式细胞技术,根据精母细胞的核型 (Hoechst染色) 分选各级精母细胞的方法。本方案获得的各级精母细胞适用于各种常规的生化和分子实验。
关键词: 小鼠, 精母细胞, Hoechst 染色, 流式细胞技术
材料与试剂
仪器设备
实验步骤
一. 睾丸组织的消化
二. Hoechst染色
三. 流式分选
四. 细胞类型验证
结果与分析
流式分选所得各级精母细胞通过核铺展结合免疫荧光染色验证细胞类型。细胞铺片以SYCP3 (联会复合体侧轴组分的标志物) 和γH2AX (指示DNA双链断裂的信号) 抗体共染免疫荧光,对所收细胞的纯度进行鉴定。细线前期精母细胞尚未发生联会复合体的组装及DNA双链断裂,其SYCP3信号呈斑块状分布,γH2AX染色弱阳性;细线期精母细胞发生联会复合体侧轴组分的组装以及DNA双链断裂,其SYCP3呈不连续的线状信号,γH2AX信号逐步积累并弥散于整个核;偶线期精母细胞阶段联会复合体侧轴组分已组装完全,发生同源染色体的联会及DNA双链断裂的修复,可见SYCP3信号为连续的线状并有不同程度的联会现象,γH2AX信号随着DNA双链断裂的修复也逐渐减少;粗线期精母细胞同源染色体完全联会,常染色体上的DNA双链断裂均已修复,SYCP3呈短棒状信号,γH2AX信号只存在于性染色体上;双线期发生同源染色体的解联会,通过SYCP3信号可观察到不同程度的解联会现象,γH2AX信号只存在于性染色体上。免疫荧光结果显示,各个阶段细胞的纯度均在70%以上,污染主要来自于相邻阶段细胞的混入 (图2A~E)。由于门的设定直接影响细胞的纯度,若对纯度有更高要求,可缩小圈选的范围。 图2. 流式分选后各级精母细胞的验证. 将流式分选的不同群体细胞进行核铺展,并结合免疫荧光进行验证。其中P5群体富集了细线前期精母细胞(A),P6群体富集了细/偶线期精母细胞(B),P7群体富集了粗线期精母细胞(C),P8群体富集了双线期精母细胞(D),标尺=100 µm。通过统计得出纯度结果(E)。
失败经验
消化所得细胞过少:
流式分选时细胞碎片过多或PI阳性细胞过多:
分选后细胞得率低:
分选后细胞纯度低:
溶液配方
致谢
本项目得到中国科学院战略性先导科技专项 (XDB19000000),国家重点研发计划(2018YFC1003401和2016YFC1000605),国家自然科学基金 (31671553),上海市科学与技术委员会基金 (17JC1420102) 以及中科院生化与细胞所基金的支持。感谢中科院生化与细胞所细胞分析技术平台、动物实验技术平台提供的技术与设施服务。本文的实验方案是在之前已发表文章 (Gaysinskaya等,2014) 的基础上改进的,已用于本实验室发表的文章 (Lin等,2017) 和 (Chen等,2018) 中。
参考文献
If you have any questions/comments about this protocol, you are highly recommended to post here. We will invite the authors of this protocol as well as some of its users to address your questions/comments. To make it easier for them to help you, you are encouraged to post your data including images for the troubleshooting.