摘要:细胞外囊泡 (extracellular vesicles,EVs) 是指由细胞分泌或者从细胞膜上脱落的脂质双分子层囊泡状小体。根据EVs生物来源、性质及功能通常被分为外泌体 (exosomes)、微囊泡 (Microvesicles/microparticles) 和凋亡小体 (Apoptosis body)。EVs不仅携带母体细胞多种特征性生物信息分子,而且可以将这些分子传递给其他细胞,在许多生理病理学过程中充当生物信息传递载体。因此,对EVs进行准确的定性及定量检测显得尤为重要。流式细胞仪理论上能对EVs进行高通量、快速及多参数的检测,是目前EVs检测的主要手段。本方案以循环微囊泡 (外周血中的微囊泡) 为例,通过电穿孔技术将超小锰磁性近红外量子点 (Ag2Se@MnQDs) 载入循环微囊泡,利用流式细胞仪对其进行检测。
关键词: 细胞外囊泡, 量子点, 标记, 流式细胞仪
材料与试剂
仪器设备
软件
实验步骤
一、循环微囊泡的提取与荧光标记 (详见图1)
二、电穿孔辅助Ag2Se@Mn量子点标记循环微囊泡及其流式细胞仪检测
三、流式细胞仪分析
结果与分析
目前,通过体外培养细胞获取微囊泡,存在诸多局限和安全隐患,体液来源的微囊泡则具有许多天然优势 (Kanada等,2015;Pitt等,2016)。 目前对于体液来源的微囊泡的可视化标记主要依赖于传统荧光染料,但这些染料自身存在光漂白、潜在的细胞毒性、弱荧光信号、非特异性标记等先天缺陷 (Resch-Genger等,2008)。本方案旨在通过电穿孔的策略将超小、近红外磁性量子点载入循环微囊泡,利用流式细胞仪实现微囊泡的定量检测 (Yu等,2017)。 收集口腔癌患者的静脉血,差速离心法收集血液中循环微囊泡并重悬于无菌PBS中。将微囊泡与Ag2Se@Mn量子点和电穿孔缓冲液混匀后,电击混合液。整个电击过程仅需40~50 ms。 图2. 蔗糖密度梯度离心法去除多余的量子点
收集混合液体,以蔗糖密度梯度离心法去除多余量子点 (图2),电穿孔处理后的微囊泡层可见Ag2Se@Mn量子点荧光信号,初步证明电穿孔法可以用于循环微囊泡的Ag2Se@Mn量子点标记。获取微囊泡层,超速离心法收集Ag2Se@Mn量子点标记的微囊泡。 流式细胞术分析结果显示,电穿孔法成功的将Ag2Se@Mn量子点载入循环微囊泡 (图3A),效率高达90%以上 (图3B)。 图3 .电穿孔辅助Ag2Se@Mn量子点标记循环微囊泡. A.流式细胞分析微囊泡。B.流式细胞术分析微囊泡Ag2Se@Mn量子点标记效率。
失败经验
溶液配方
致谢
本文实验方案改编自武汉大学口腔医院余自力博士发表的论文,所述微囊泡由余博士提供,相关流式细胞检测方法由中科院武汉病毒所分析测试中心建立并完成。
参考文献
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