摘要:流式细胞术 (FCM) 可通过分析受感染细胞来间接检测病毒或其抗原,然而该方法存在测量过程繁琐、耗时长、误差大等缺点。伴随FCM的不断发展,其检测范围已不再局限于细胞,目前已可利用流式细胞仪直接分析各类形态和基因组大小各异 (直径范围:100~200 nm) 的病毒,如杆状病毒、带状疱疹病毒、HIV-1病毒等。跟病毒的其他检测方法相比,FCM法具有重复性好、简便快速、可获取多参数信息等优势。除此之外,FCM得到的荧光分布结果还可进一步用于病毒蛋白合成及病毒颗粒释放等数据的统计估算和数学建模。本文以含有GFP荧光蛋白的HIV慢病毒为例,简要介绍一种利用FCM对其进行检测的方法。
关键词: 流式细胞仪, GFP荧光蛋白, HIV慢病毒, 检测
材料与试剂
仪器设备
软件
实验步骤
一、慢病毒的制备
二、流式细胞术检测慢病毒
流式细胞仪的参数设置:建立双参数FSC/SSC散点图和EGPF/SSC双参数散点图,根据其信号调节光电倍增管电压,得到合适的流式图。流式细胞仪选用70 µm的喷嘴,设前向角 (FSC) 电压值为10 V,侧向角 (SSC) 为250 V,荧光通道PMT电压调整至合适值,确保经0.1 μm滤头过滤后的PBS缓冲液上样后,在最低流速度下的颗粒数< 10 events/s。在双参数 FSC/SSC或者EGPF/SSC散点图中找到病毒最集中的区域设门,圈出所需要分析的病毒,并用FlowJo v10.0.8软件进行数据分析。
结果与分析
常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和慢病毒。逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞,而且容量有限,腺病毒一般不能整合到染色体上,只能进行瞬时感染。与其他逆转录病毒相比,慢病毒具有可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大、可以长期表达等显著优点。慢病毒不产生任何有效的细胞免疫应答,可作为一种体外基因运输的工具。慢病毒载体介导的转基因表达能持续数月,且无可观察到的病理学现象。因此,慢病毒载体在基因转染中的应用极为广泛,本文以其为例,通过FCM分析其荧光标记效率。
在正式检测病毒之前,我们首先利用流式分析仪检测不同尺寸的商品化聚苯乙烯绿色荧光微球,以此验证流式细胞仪对微纳米尺度的颗粒的分析性能 (Vlasak等,2016;Bonar和Tilton,2017)。结果如图1所示,我们选用的流式细胞仪对200 nm以上的微颗粒具备分辨能力。 图1. 流式细胞仪通过FSC和SSC分析不同尺寸的荧光微球获得的散点图 慢病毒尺寸在120至150 nm范围内,因此传统基于FSC和SSC获取散点的办法并不适用。但是我们发现,当HIV慢病毒颗粒带有GPF荧光标签后,利用荧光强度代替FSC作为阈值筛选条件,可以将病毒区分开来。如图2所示,标记有GFP的病毒可以出现明显的散点群落,而未标记的野生型并未出现。 图2. 流式细胞仪GFP荧光通道和SSC分析野生型和GFP标记的HIV慢病毒获得的散点图
失败经验
溶液配方
致谢
本文实验方案改编自美国凯斯西储大学 Michał M. Bonar, John C. Tilton于2017年发表在Virology杂志上的文章 (Bonar和Tilton, 2017)。
参考文献
If you have any questions/comments about this protocol, you are highly recommended to post here. We will invite the authors of this protocol as well as some of its users to address your questions/comments. To make it easier for them to help you, you are encouraged to post your data including images for the troubleshooting.