微环境内MDSC亚群流式检测   

金静思金静思*杨超杨超*邓刘福邓刘福  (*contributed equally to this work)
How to cite Favorites Q&A Share your feedback Cited by

摘要:在肿瘤免疫微环境中主要起着促肿瘤作用的髓系来源抑制细胞 (myeloid derived suppressor cells,MDSCs)可分为多形核髓系来源抑制细胞 (polymorphonucear MDSCs,PMN-MDSCs) 和单核髓系来源抑制细胞 (monocytic MDSCs, M-MDSCs) (Engblom等,2016)。肿瘤中MDSCs的来源、分化及其功能正是一大研究热点,由于肿瘤内浸润免疫细胞的多样性及复杂性,流式技术成为分析MDSCs的主要手段 (Bronte等,2016)。该文旨在阐述运用流式技术分析肿瘤微环境内MDSCs的亚群,此方法可为后续MDSCs分选及其功能检测实验奠定基础。

关键词: 髓系来源抑制细胞, 肿瘤微环境, 流式技术

材料与试剂

材料:

  1. 眼科剪及眼科镊
  2. 1 ml移液枪及枪头
  3. 6孔细胞培养平底板 (NEST®, catalog number: 032819AA01)
  4. 96孔细胞培养U底板 (NEST®, catalog number: 112518AA03)
  5. 15 ml离心管 (Thermo Fisher Scientific, NuncTM, catalog number: 339650)
  6. 50 ml离心管 (Thermo Fisher Scientific, NuncTM, catalog number: 339652)
  7. 无菌注射器 (上海康德莱企业发展有限公司,KDL®)
  8. 70 μm孔径滤网 (Corning, Falcon®, catalog number: 352350)
  9. 5 ml无菌圆底管 (带滤网) (Corning,Falcon®, catalog number: 352235)
试剂:
  1. 胎牛血清 (Gemini, FoundationTM, catalog number: 900-108)
  2. Anti-FcR (CD16/CD32) 抗体 (BioXCel,catalog number: BE0307)
  3. 胶原蛋白酶I (Worthington Biochemical®, catalog number: LS004186,-20 °C储存)
  4. 脱氧核糖核酸酶I,来源于牛胰腺 (Sigma-Aldrich®, catalog number: DN25, -20 °C储存)
  5. DMEM基础高糖培养液 (HycloneTM, catalog number: SH30243.01)
  6. PBS (HycloneTM, catalog number: SH302560.31)
  7. 乙醇
  8. 5% DMEM培养液 (见溶液配方)
  9. FACS buffer (见溶液配方)
  10. 肿瘤组织消化液 (见溶液配方)
抗体:
  1. Anti-FcR (CD16/CD32) (BioXCell, BioXCell, catalog number: BE0307)
  2. Fixable Viability Stain 780 (BD Bioscience, BD, catalog number: 565388)
  3. Anti-mouse-CD45.2-BV785 (Biolegend,  catalog number: 109839)
  4. Anti-mouse-Ly6C-BV605 (Biolegend, catalog number: 128035)
  5. Anti-mouse-Ly6G-BV711 (Biolegend,  catalog number: 127643)
  6. Anti-mouse-CD11b-PE/Cy7 (Biolegend,  catalog number: 101216)

仪器设备

  1. 37 °C二氧化碳培养箱 (Thermo Fisher Scientific)
  2. 电热恒温水槽 (上海一恒科学仪器有限公司,model: DK-8AXX)
  3. 低温离心机 (Eppendorf®, model: 5810R)
  4. 微型台式真空泵GL-802B型 (Kylin-bell®, model: GL-802B型)
  5. Flow Cytometer (BD, model: LSRfortessa, or equivalent)
  6. 恒温细胞培养箱
  7. 超净工作台

实验步骤

  1. 前期准备工作
    1.1
    分组标记:根据实验分组需求取若干六孔板,标记荷瘤小鼠信息。六孔板中每孔加入3 ml DMEM高糖培养基,将六孔板置于冰上待用。
    1.2
    配制肿瘤组织消化液:将预先配制的100× 消化液母液 (含100 mg/ml胶原酶I和20 mg/ml DNA酶I) 用含5% FBS的DMEM高糖培养基稀释100倍,即最终工作浓度为1 mg/ml胶原酶I和200 μg/ml DNA酶I。将1× 消化液置于37 °C水浴锅预热待用。
    1.3
    器械准备:根据实验分组需求准备适量的剪刀镊子,用双蒸水洗净后75%乙醇消毒,烘干备用。
  2. 肿瘤组织的分离

采用颈椎脱臼法将荷瘤小鼠处死,喷洒75%乙醇消毒。左手持弯镊,右手持剪刀在肿瘤右侧1 cm处沿肿瘤边缘剪开一长约2 cm口子。左手捏住剪开处的皮肤向外翻折,可清晰见到肿瘤附着于皮下。用剪刀沿肿瘤边缘轻轻剪开,将肿瘤剥离,注意肿瘤若有溃烂,则避开溃烂之处。将剥离下来的肿瘤组织放入预先准备好的六孔板内。

  1. 肿瘤组织的剪碎

待全部肿瘤剥离完毕,用移液枪吸出预留DMEM高糖培养基,余大约0.1 ml,以免在剪碎过程中肿瘤组织干燥。手持剪刀小幅度高频率剪碎肿瘤组织,将肿瘤组织剪成泥浆状,肉眼无法看见清晰组织块。注意以上步骤均在冰上操作。

  1. 肿瘤组织的消化

将肿瘤组织剪成泥浆状后,每孔加入2 ml 1× 消化液,用1 ml枪头将肿瘤组织碎末打散,置于37 °C恒温细胞培养箱消化30 min,每隔10 min将六孔板取出晃动混匀一次。注意严格按照时间消化,以免影响免疫细胞活性;可根据肿瘤大小调整1× 消化液的用量。

  1. 制备肿瘤细胞悬液

消化完毕后,将六孔板取出放于冰板上,每孔加入4 ml DMEM高糖培养基 (含5% FBS) 终止消化。用巴氏吸管吸取肿瘤组织悬液至70 μm细胞滤网过滤,同时用1 ml注射器后部研磨遗留在滤网上的组织块 (注意研磨时切勿用力,易将脂肪等带入细胞悬液中),用DMEM高糖基础培养基冲洗滤网上的组织块,所得肿瘤悬液4 °C,850 x g,离心5 min。

  1. 染色前封闭

由于髓系细胞表面表达较多Fc受体,容易对流式抗体有非特异性结合,故采用预先阻断Fc受体封闭。离心后弃上清,根据沉淀多少加入适量FACS缓冲液混匀,取10 μl细胞悬液计数,将悬液细胞密度调至2 × 107个/ml。取100 μl细胞悬液于U底96孔内,按100:3比例加入抗Fc受体抗体 (即每100 μl细胞悬液加入3 μl抗Fc受体抗体),4 °C孵育30 min。

  1. 配制流式染色抗体

按照表1配制流式抗体混合液 (用FACS缓冲液配制),每孔加入70 μl流式抗体混合液,根据需要计算每个流式抗体所需体积。


表1. 肿瘤微环境内MDSCs流式染色配色


注:流式抗体使用配色可自行调整,注意不要使用补偿过大的荧光通道。

  1. 流式染色

封闭结束后,4 °C,850 x g,离心5min。弃上清,每孔加入70 μl流式抗体混合液,轻柔吹打混匀,注意不要有气泡。将96孔板置于4 °C避光,染色30 min。

  1. 洗涤、上机

染色结束后每孔加入200 μl FACS缓冲液,4 °C,850 x g,离心5min。弃上清后再次加入200 μl FACS缓冲液洗涤一次,4 °C,850 x g,离心5min。弃上清,加入300 μl FACS缓冲液重悬细胞,将细胞悬液转移至带滤网的流式管中 (同时过滤细胞悬液)。制备好的流式染色样品用BD Fortessa进行分析,数据处理软件采用FlowJo Version 10.0。

结果与分析

设门方式 (图1):
PMN-MDSC:Single cell, live, CD45+Ly6CintLy6G+CD11b+
M-MDSC: Single cell, live, CD45+Ly6ChiLy6G-CD11b+


图1. 肿瘤内MDSC的设门方式

溶液配方

注:以下溶液均在超净台内配置。

  1. 5% DMEM培养液
    DMEM基础高糖培养液 + 5%胎牛血清
    4 °C冷藏,1个月内使用
  2. FACS buffer
    PBS + 2%胎牛血清
    4 °C冷藏,1周内使用
  3. 肿瘤组织消化液
    5% DMEM培养液 + 胶原蛋白酶I (工作浓度:1 mg/ml) + 脱氧核糖核酸酶I (工作浓度:200 μg/ml)

参考文献

  1. Bronte, V., Brandau, S., Chen, S. H., Colombo, M. P., Frey, A. B., Greten, T. F., Mandruzzato, S., Murray, P. J., Ochoa, A., Ostrand-Rosenberg, S., Rodriguez, P. C., Sica, A., Umansky, V., Vonderheide, R. H. and Gabrilovich, D. I. (2016). Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards. Nat Commun 7: 12150.
  2. Engblom, C., Pfirschke, C. and Pittet, M. J. (2016). The role of myeloid cells in cancer therapies. Nat Rev Cancer 16(7): 447-462.
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:金静思, 杨超, 邓刘福. (2019). 微环境内MDSC亚群流式检测. Bio-101: e1010312. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010312.
How to cite: Jin, J. S., Yang, C. and Deng, L. F. (2019). The Detection of Myeloid Derived Suppressor Cells in the Tumor Microenvironment by Flow Cytometry. Bio-101: e1010312. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010312.
Q&A

Please login to post your questions/comments. Your questions will be directed to the authors of the protocol. The authors will be requested to answer your questions at their earliest convenience. Once your questions are answered, you will be informed using the email address that you register with bio-protocol.
You are highly recommended to post your data including images for the troubleshooting.

You are highly recommended to post your data (images or even videos) for the troubleshooting. For uploading videos, you may need a Google account because Bio-protocol uses YouTube to host videos.