果蝇无菌培养   

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Rice Protocol e-book

 

摘要:主要介绍如何收集果蝇胚胎,并对胚胎进行漂洗灭菌,然后置于含抗生素的果蝇食物上进行无菌培养,以获得无菌果蝇,用于需要排除细菌干扰的实验。

关键词: 果蝇, 无菌, 培养

材料与试剂

  1. 1.5 ml离心管
  2. 果蝇培养瓶 (Genesee Scientific, catalog number: 32-130)
  3. Kimwipes纸巾 (Kimberly-Clark Worldwide, Inc., catalog number: 34155)
  4. 果蝇胚胎收集笼 (Genesee Scientific, catalog number: 59-101)
  5. 100 μm细胞滤网筛 (Corning Incorporated-Life Sciences, catalog number: 352360)
  6. 博格利诺勾线笔
  7. 50只雄果蝇和50只雌果蝇
  8. PCR引物 (真细菌的通用引物27F和1492R)
    27F:5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
    1492R:5‘-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’
  9. 高糖型马利活性干酵母 (英联马利(北京)食品销售有限公司)
  10. 84消毒液 (江苏爱特福84股份有限公司)
  11. Ampicillin sodium (生工生物工程(上海)股份有限公司,catalog number: A610028)
  12. Tetracyclinehydrochloride (生工生物工程(上海)股份有限公司,catalog number: A600504)
  13. Rifamycin (生工生物工程(上海)股份有限公司,catalog number: A600808)
  14. PCR试剂 (上海翊圣生物科技有限公司,catalog number: 10102ES08)
  15. LB肉汤培养基 (生工生物工程(上海)股份有限公司,catalog number: A507002)
  16. Agar A (生工生物工程(上海)股份有限公司,catalog number: A600010)
  17. 蔗糖 (上海实验试剂有限公司)
  18. 麦芽糖 (上海实验试剂有限公司)
  19. 苯甲酸钠 (国药集团化学试剂有限公司,catalog number: 30164817)
  20. 对羟基苯甲酸甲酯 (国药集团化学试剂有限公司,catalog number: 30119426)
  21. 丙酸 (国药集团化学试剂有限公司,catalog number: 81011918)
  22. 95%乙醇 (国药集团化学试剂有限公司,catalog number: 10009164)
  23. 琼脂粉 (生工生物工程(上海)股份有限公司,catalog number: A505255)
  24. 玉米粉 (上海仕林生物科技有限公司)
  25. 黄豆粉 (上海仕林生物科技有限公司)
  26. 食物平板 (见溶液配方)
  27. 酵母泥 (见溶液配方)
  28. 苹果汁板 (见溶液配方)
  29. 固体平板 (见溶液配方)
  30. 抗生素食物 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 果蝇培养箱 (Percival Scientific, Inc., model: DR-41VL)
  2. 离心机 (Eppendorf)
  3. 生物安全柜 (苏州净化,catalog number: SW-CJ-1D)
  4. PCR仪 (BIO-RAD,model: T100TMThermal Cycler)
  5. 电饭锅 (上海元山电器工业有限公司,model: YS-RC20B08S)
  6. 电泳槽 (BIO-RAD,catalog number: 170-4469)
  7. 电泳电源 (BIO-RAD,catalog number:164-5052)
  8. 凝胶成像仪 (Proteinsimple,model: SA-1000 [Red])
  9. 立式压力蒸汽灭菌器 (上海申安医疗器械厂,model: LDZH-200KBS)

实验步骤

一、果蝇无菌培养

  1. 果蝇培养条件:温度25 °C;湿度60%,光照时间段为早上7点至晚上7点。准备4个含有正常食物的果蝇培养瓶,每个培养瓶里各放50只雄果蝇和50只雌果蝇。
  2. 3天后,倒掉果蝇成虫,每个培养瓶放一张kimwipes纸巾,增加蛹依附的空间,以收到更多的成虫。
  3. 第10天开始收集成虫,共收集两天,并全部集中放到果蝇胚胎收集笼中 (约1,200只),继续培养两天。
    注:
    1)  食物平板在上,减少果蝇成虫因密集而损失。收集卵时,苹果汁板在下,以便于短时间内收集大量的卵。
    2)  果蝇胚胎收集笼中放入2张kimwipes纸巾可以保持环境干燥。
  4. 果蝇胚胎收集笼中培养的第三天,在食物平板上抹适量酵母,更换干净的果蝇胚胎收集笼和kimwipes纸巾。
  5. 果蝇胚胎收集笼中培养的第四天开始预产卵,将果蝇转移至一个干净的果蝇胚胎收集笼中,换上抹有酵母泥的苹果汁板。
  6. 每间隔2小时更换一个苹果汁板,将卵用100 μm的细胞滤网筛收集起来。
  7. 用慢流速的自来水冲洗1分钟,避免直接对着卵操作,用干纸巾吸干水分。
  8. 50%的84消毒液漂洗2分钟。
  9. 重复步骤7一次。
  10. 在生物安全柜中,70%的乙醇漂洗2分钟。
  11. 重复步骤10一次。
  12. 无菌水漂洗2分钟。
  13. 重复步骤12一次。
  14. 用干净的博格利诺勾线笔将适量的卵分装进抗生素食物中。
    注:抗生素食物预先用镊子捣碎,方便搁置卵。
  15. 成虫出来后转移至抗生素食物管中,每间隔2~3天更换新的食物。

二、无菌果蝇验证 (Chen等,2014)

  1. 以成虫果蝇匀浆为模板,PCR扩增16s rRNA (Weisburg等,1991)。
  2. 将正常培养果蝇和无菌处理果蝇分别收集10只至1.5 ml的离心管中,均用无菌水洗三遍,再转移至固体平板上,直接用涂板的玻璃棒碾碎涂匀,37 °C倒置培养48 h,看是否会长菌。如图1所示,正常果蝇匀浆涂板48 h后,长出两个菌落 (红色方框所示),而无菌处理的果蝇匀浆涂板48 h后则没有发现菌落。


    图1. 果蝇匀浆后涂板培养

溶液配方

  1. 果蝇正常食物
    蔗糖320 g
    麦芽糖339.2 g
    高糖型马利活性干酵母200 g
    琼脂粉48 g
    黄豆粉73.44 g
    玉米粉534.6 g
    双蒸水8.9 L
    先用1 L双蒸水预混为匀浆,7.9 L双蒸水用电饭锅煮沸后缓慢倒入匀浆,煮20分钟,冷却至70 °C,加溶于20 ml 95%乙醇的对羟基苯甲酸甲酯2 g,苯甲酸钠8 g,丙酸55 ml,搅匀
    分装至10 cm平板 (20 ml每平板)
    分装至果蝇培养瓶 (30 ml每培养瓶)
  2. 酵母泥
    5 g高糖型马利活性干酵母溶于8 ml双蒸水,混匀
  3. 苹果汁板
    200 ml双蒸水
    100 ml苹果汁
    6 g琼脂
    微波炉煮沸,分装至10 cm平板
  4. 固体平板
    2.5 g LB肉汤培养基
    3.0 g Agar A
    溶于100 ml双蒸水,高温灭菌,分装至10 cm平板
  5. 抗生素食物
    1)
    果蝇管用紫外照射18小时
    2)
    用50%乙醇配制含有5mg/ml ampicillin sodium,500 μg/ml tetracyclinehydrochloride,2 mg/ml rifamycin的抗生素储存液,再取5 ml加入500 ml正常食物中,搅匀后分装
    注:
    1. 食物的温度一般在55 °C时加入抗生素,避免温度影响抗生素。
    2. 制备好的抗生素食物建议避光保存。
    3)
    对照组食物加入等量的50%乙醇

参考文献

  1. Chen, H.Y., Zheng, X. B., Zheng,Y. X. (2014). Age-associated loss of lamin-B leads to systemic inflammation and gut hyperplasia. Cell 159: 829-843.
  2. Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., and Lane, D. J. (1991). 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J Bacteriol 173: 697-703.
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:邓娟, 刘南. (2019). 果蝇无菌培养. Bio-101: e1010296. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010296.
How to cite: Deng, J. and Liu, N. (2019). Axenic Fly Cultures. Bio-101: e1010296. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010296.
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