Detection of Cell Cycle Checkpoint in Drosophila by EdU Assay, BrdU Assay and Anti-Phosphorylated Histone 3 Antibody Staining   

方法1：EdU法检测果蝇幼虫眼成虫盘S期检验点
  

摘要：使用EdU法检测果蝇幼虫眼成虫盘中的S期检验点 (Daul等，2010；Song等，2018)。

材料与试剂

1. 盖玻片(22 × 22 mm)
2. 标准级显微镜载载玻片(25 × 75 mm，厚度1 mm ± 0.2 mm)
3. 解剖皿
4. 1.5 ml离心管
5. 果蝇三期幼虫
6. 羟基脲 (Hydroxyurea, HU)
7. 果蝇食物
8. 1× PBS
9. Triton X-100 (Sigma, catalog number: T8787)
10. 1× Click reaction buffer
11.  CuSO₄
12. Alexa Fluorazide
13. Reaction buffer additive
14. SFX-Insect培养液 (HyClone, catalog number: SH30278.02) (4 °C保存)
15. Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit (Invitrogen, catalog number: C10337) (4 °C保存) (见溶液配方)
16. 抗荧光淬灭剂 (Beyotime, catalog number: P0128) (-20 °C保存)
17. 指甲油
18. 0.5% PBST (见溶液配方)
19. 3% BSA (见溶液配方)
20. 3.7%甲醛 (新鲜配制) (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 解剖镊
2. 解剖显微镜 (奥林帕斯，model: SZ51)
3. 转移脱色摇床 (奥豪斯，model: TS-8)
4. 共聚焦显微镜 (徕卡，model: TCS SP5) 或正置荧光显微镜 (蔡司，model: Imager Z2)
   

实验步骤

1. 收集活跃的果蝇三期幼虫，使用辐照或羟基脲 (Hydroxyurea, HU) 处理实验组果蝇，诱导产生DNA损伤。将实验组果蝇和对照组果蝇幼虫放置于捣碎的食物中，25 °C培养2 h。
2. 挑取实验组和对照组果蝇幼虫各15只，在装有1× PBS的解剖皿中一次解剖果蝇幼虫，将幼虫眼成虫盘和肌肉组织一起解剖出来，清除干净脂肪，放入含有1 ml SFX-Insect培养液的离心管中。
3. 加入1 μl 10 mM EdU溶液，放置于摇床上，室温慢速孵育20 rpm/min × 30 min。
4. 吸去上清，加入1 ml 3.7%甲醛溶液，放置于摇床上，室温慢速固定20 rpm/min ×15 min。
5. 吸去上清，加入1 ml 3% BSA溶液，清洗2遍。
6. 吸去上清，加入1 ml 0.5% PBST，放置于摇床上，室温慢速通透处理20 rpm/min × 20 min。
7. 吸去上清，加入1 ml 3% BSA溶液，清洗2遍。
8. 吸去上清，加入100 μl Click反应液，室温避光孵育30 min。
9. 吸去上清，加入1 ml 3% BSA溶液，清洗1遍。
10. 在平皿中加一滴1× PBS，二次完全解剖幼虫眼成虫盘。
11. 加一滴抗荧光淬灭剂于载玻片上，转移幼虫眼成虫盘至抗荧光淬灭剂中。盖上干净的盖玻片，四周涂上指甲油，4 °C保存样品。
    注：尽快进行拍照，样品保存不超过3天。
    
12. 显微镜观察 (图1)。
    
    
    图1. EdU法检测果蝇三期幼虫眼成虫盘的S期检验点. 在HU药物处理后，位于眼成虫盘形态发生沟前区的EdU阳性细胞数明显减少，荧光强度明显减弱。比例尺：50 μm。
    
    

方法2：BrdU法检测果蝇幼虫脑组织S期检验点
  

摘要：使用BrdU法检测果蝇大脑组织中的S期检验点 (Jaklevic和Su，2004；Song等，2018)。

材料与试剂

1. 解剖皿
2. 标准级显微镜载载玻片 (25 × 75 mm，厚度1 mm ± 0.2 mm)
3. 盖玻片 (22 × 22 mm)
4. 1× PBS
5. Triton X-100 (Sigma, catalog number: T8787)
6. SFX-Insect培养液 (HyClone, catalog number: SH30278.02) (4 °C保存)
7. 3.0 N HCl
8. 羊血清
9. BrdU (Roche, catalog number: 10280879001)
10. anti-BrdU抗体 (Sigma, catalog number: B2531)
11. 二抗 (相应于一抗)
12. Alexa Fluor 488 (Cell Signaling Technology, catalog number: 4408S) (4 °C保存)
13. 抗荧光淬灭剂 (Beyotime, catalog number: P0128) (-20 °C保存)
14. 指甲油
15. 0.3% PBST (见溶液配方)
16. 3.7%甲醛 (新鲜配制) (见溶液配方)
17. 封闭液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 解剖镊
2. 解剖显微镜 (奥林帕斯，model: SZ51)
3. 转移脱色摇床 (奥豪斯，model:TS-8)
4. 共聚焦显微镜 (徕卡，model: TCS SP5) 或正置荧光显微镜 (蔡司，model: Imager Z2)
   

实验步骤

1. 挑取DNA损伤处理后的实验组和对照组果蝇三期幼虫各15只，在装有1× PBS的解剖皿中一次解剖果蝇幼虫，将大脑和肌肉组织一起解剖出来，清除干净脂肪，放入含有1 ml SFX-Insect培养液的离心管中。
2. 加入40 μl 10 mg/mlBrdU母液，放置于摇床上，室温慢速孵育20 rpm/min × 15 min。
3. 吸去上清，加入800 μl 3.7%甲醛溶液，放置于摇床上，室温慢速固定20 rpm/min × 20 min。
4. 吸去上清，加入800μl 0.3% PBST溶液，放置于摇床上，室温慢速清洗20 rpm/min × 10 min，清洗3遍。
5. 吸去上清，加入200 μl 3.0 N HCl，室温浸泡30 min。
6. 吸去上清，加入800 μl 0.3% PBST溶液，放置于摇床上，室温慢速清洗20 rpm/min × 10 min，清洗3遍。
7. 吸去上清，加入800 μl封闭液，放置于摇床上，室温慢速孵育20 rpm/min × 2 h。
8. 吸去上清，加入100 μl 1:200稀释的抗BrdU抗体，4 °C孵育过夜，
9. 回收抗体。加入800 μl 0.3% PBST溶液，放置于摇床上，室温慢速清洗20 rpm/min × 10 min，清洗3遍。
10. 吸去上清，加入200 μl 1:400稀释的抗一抗种属的相应二抗，室温避光孵育2 h。
11. 吸去上清，加入800 μl 0.3% PBST溶液，放置于摇床上，室温慢速清洗20 rpm/min × 10 min，清洗3遍。
12. 在干净平皿中加一滴1× PBS，二次完全解剖大脑组织。
13. 加一滴抗荧光淬灭剂于载玻片上，用镊子轻托大脑至抗荧光淬灭剂中。盖上干净的盖玻片，四周涂上指甲油，4 °C保存样品。
    注：尽快进行拍照，样品保存不超过3天。
    
14. 显微镜观察 (图2)。
    
    
    图2. BrdU法检测果蝇三期幼虫大脑组织S期检验点. 在HU药物处理后，大脑组织的BrdU阳性细胞数明显减少，荧光强度明显减弱。比例尺：50 μm。
    
    

方法3：p-H3抗体检测果蝇幼虫翅膀成虫盘G2/M检验点
   

摘要：使用抗磷酸化组蛋白3-H3Ser10抗体 (p-H3) 免疫染色方法检测G2/M检验点 (Liu等，2012；Yuan等，2018)。

材料与试剂

1. 标准级显微镜载载玻片 (25 × 75 mm，厚度1 mm ± 0.2 mm)
2. 盖玻片 (22 × 22 mm)
3. 解剖皿
4. 1.5 ml离心管
5. 果蝇三期幼虫
6. 1× PBS
7. Triton X-100 (Sigma, catalog number: T8787)
8. 3.7%甲醛 (新鲜配制)
9. 二抗 (相应于一抗)
10. Anti-phospho Histone H3 (Ser10) antibody (Millipore, catalog number: 2900699) (4 °C保存)
11. Alexa Fluor (anti-rabbit)488 (Cell Signaling Technology, catalog number: 4412S) (4 °C保存)
12. 抗荧光淬灭剂 (Beyotime, catalog number: P0128) (-20 °C保存)
13. 指甲油
14. 0.3% PBST (见溶液配方)
15. 封闭液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 解剖镊
2. 解剖显微镜 (奥林帕斯，model: SZ51-SET)
3. 转移脱色摇床 (奥豪斯，model: TS-8)
4. 共聚焦显微镜 (徕卡，model: TCS SP5) 或正置荧光显微镜 (蔡司，model: Imager Z2)
   

实验步骤

1. 挑取DNA损伤处理后的实验组和对照组果蝇三期幼虫各15只，在装有1× PBS的解剖皿中一次解剖果蝇幼虫，将翅膀成虫盘和肌肉组织一起解剖出来，清除干净脂肪，放置于冰浴的1.5 ml离心管中。
2. 吸去上清，加入800 μl 3.7%甲醛，放置于摇床上，室温慢速固定20 rpm/min × 20 min。
3. 吸去上清，加入800 μl 0.3% PBST，放置于摇床上，室温慢速清洗20 rpm/min × 10 min，清洗3次。
4. 吸去上清，加入800 μl封闭液，室温封闭1 h。
5. 吸去上清，加入100 μl 1:100稀释的抗p-H3抗体，4 °C孵育过夜。
6. 回收抗体。加入800 μl 0.3% PBST，放置于摇床上，室温慢速清洗20 rpm/min × 10 min清洗3次。
7. 吸去上清，加入800 μl封闭液，放置于摇床上，室温慢速清洗20 rpm/min × 15 min。
8. 吸去上清，加入200 μl 1:400稀释的抗一抗种属的相应二抗，室温避光孵育2 h。
9. 吸去上清，加入800 μl 0.3% PBST，放置于摇床上，室温避光慢速清洗20 rpm/min × 15 min，清洗3次。
10. 在平皿中加一滴1× PBS，二次完全解剖翅膀成虫盘。
11. 加一滴抗荧光淬灭剂于载玻片上，用镊子轻托样品至抗荧光淬灭剂中。盖上干净的盖玻片，四周涂上指甲油，4 °C保存样品。
12. 显微镜观察 (图3)。
    
    
    图3. 抗p-H3抗体染色检测果蝇三期幼虫翅膀成虫盘G2/M检验点. 共聚焦显微镜拍摄，HU处理后，果蝇翅膀成虫盘中阳性信号明显减少。比例尺：50 μm。
    
    注：
    
    1)

    解剖是实验成功的关键。第一次解剖时，将成虫盘或大脑与肌肉一起解剖，并使成虫盘或大脑尽可能暴露，剔除干净周围脂肪组织，有助于减少非特异结合。
    2)

    吸去上一步液体时，去除干净残留液体，包括离心管盖子里的液体，减少残留液体对下一步实验操作的影响。
    3)

    进行通透处理时，孵育时间要恰当，避免孵育时间过长，造成通透过度。
    4)

    Click反应液现配现用，使用前15 min内配制。
    5)

    操作要准确、快速，减少样品暴露在光照下的时间。
    6)

    转移成虫盘或大脑样品至载玻片时，携带的液体宜少，以免盖玻片滑动损伤样品。注意枪头中是否有未转移的成虫盘或大脑样品，如果有，要重新转移样品。
    7)

    封片动作要轻柔，以免盖玻片滑动损坏样品。
    8)

    尽快进行拍照，样品保存不超过3天。

溶液配方

1. 0.5% PBST (EdU染色专用)
   99.5 ml 1× PBS
   0.5 ml Triton X-100 (Sigma, T8787)
   4 °C保存
2. 3% BSA (EdU染色专用)
   0.03 g BSA
   1 ml 1× PBS
   现配现用
3. Click反应液 (EdU染色专用)
   430 μl 1× Click reaction buffer
   20 μl CuSO₄
   1.2 μl Alexa Fluorazide
   50μl Reaction buffer additive
   用前15 min内配制
4. 3.7%甲醛
   9.6 ml 1× PBS
   0.4 ml甲醛 (Sigma, F8775)
   现配现用
5. 0.3% PBST
   99.7 ml 1× PBS
   0.3 ml Triton X-100
   4 °C保存
6. 封闭液 (p-H3染色专用)
   950 μl 0.3% PBST
   50 μl羊血清
   现配现用
7. 封闭液 (BrdU染色专用)
   90 ml 0.3% PBST
   10 ml羊血清
   现配现用

致谢

感谢实验室所有过去和现在成员的工作，完善了本文方法。这项工作得到了国家重大基础研究项目–“973”项目 (2010CB934004)，国家自然科学基金项目 (31771437，31501165，31271480，30871388)，中国科学院“百人计划”，辽宁省“攀登学者”的支持。
以上实验方法已在下列论文中使用：Liu等 (2012)；Song等 (2018)；Yuan等 (2018)。
作者贡献声明：本文中方法1，2由王清华撰写，徐起，王清华修改；方法3由徐起撰写，王清华，徐起修改；秘晓林审校。

参考文献

1. Daul, A. L., Komori, H. and Lee, C. Y. (2010). EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring HarbProtoc 2010(7): pdb prot5461.
2. Jaklevic, B. R. and Su, T. T. (2004). Relative contribution of DNA repair, cell cycle checkpoints, and cell death to survival after DNA damage in Drosophila larvae. Curr Biol 14(1): 23-32.
3. Liu, W., Jiang, F., Bi, X. and Zhang, Y. Q. (2012). Drosophila FMRP participates in the DNA damage response by regulating G2/M cell cycle checkpoint and apoptosis. Hum Mol Genet 21(21): 4655-4668.
4. Song, F., Li, D., Wang, Y. and Bi, X. (2018). Drosophila Caliban mediates G1-S transition and ionizing radiation induced S phase checkpoint. Cell Cycle 17(18): 2256-2267.
5. Yuan, Q., Tian, R., Zhao, H., Li, L. and Bi, X. (2018). Multiple arginine residues are methylated in Drosophila Mre11 and required for survival following ionizing radiation. G3 (Bethesda) 8(6): 2099-2106.