实验原理:免疫荧光染色技术是基于具有荧光色素标记的特异性抗体和待测抗原进行结合,进而通过激光激发荧光色素来实现在组织和细胞中对某种特定蛋白的定性检测技术。本实验方法使用的第一抗体不作荧光标记,使用与第一抗体种属相同抗体的Fc段作为抗原免疫动物而制备的抗抗体,即第二抗体,并用荧光素标记第二抗体。反应时,特异性的第一抗体与细胞中相应的待测抗原反应结合,然后缓冲液洗掉未结合的第一抗体,再用荧光素标记的第二抗体与结合在抗原上的第一抗体结合,最终形成抗原—抗体—荧光抗体复合物。在激光扫描共聚焦显微镜下,通过相应波长的激光激发荧光素,从而接受信号形成图像。 实验目的:检测某种特定蛋白在果蝇精巢中的表达分布情况。
关键词: 果蝇, 精巢, 免疫荧光染色
材料与试剂
一、实验材料
二、实验对象
三、试剂与溶液
仪器设备
实验步骤
实验结果
在成体果蝇中,中心细胞 (hub) 位于精巢顶端,而胞囊干细胞 (cyst stem cell, CySC) 和生殖干细胞 (germline stem cell, GSC) 与hub紧密接触,它们共同形成一个“花环型”结构。每个GSC由一对CySC包裹,并同时进行不对称分裂,靠近hub的子细胞维持干细胞特性,而远离hub的子细胞形成一个精原母细胞 (gonialblast, GB) 和两个胞囊细胞 (cyst cell)。然后精原母细胞 (gonialblast, GB) 增殖形成精原细胞 (spermatogonial, SG),精原细胞经过4次不完全有丝分裂,增殖至16细胞期,并分化成精母细胞 (spermatocyte, SC),开始减数分裂,最终分化成精细胞 (Greenspan等,2015)。 通过本实验方法,我们对精巢组织中的发育早期细胞进行免疫荧光染色 (图1)。基于gal4/uas系统,我们构建了一种在胞囊细胞世系中特异表达的驱动子c587-gal4,驱动胞囊细胞中uas-gfp表达 (图1B)。Vasa在生殖细胞世系中特异表达。我们实验室制备了兔源Vasa的抗体。为了寻找合适的稀释比例,我们解剖了多组样品,设置了一抗稀释梯度,使用的二抗是Cy3标记的驴抗兔IgG。图1C展示了我们摸索的最适抗体浓度下的染色结果。GFP,DAPI,Cy3三种荧光的激发光和收集光谱均不同,可以在激光扫描共聚焦显微镜下打开三个通道同时检测。综上,本实验结果较为形象地展示出了精巢组织中发育早期的组织结构,通过对Vasa染色将生殖细胞世系与其他类型细胞区分开来,以便于观测生殖细胞的发育状态。 图1. 成体果蝇精巢顶端组织结构. A. 蓝色显示的是细胞核DNA。B. GFP由c587-gal4驱动,在胞囊细胞世系中特异表达。C. Vasa标记生殖细胞世系。D. 本图显示的是三个通道叠加。图中白色箭头指示中心细胞hub,比例尺:10 μm。
溶液配方
致谢
该实验方案改编自首都师范大学赵航硕士毕业论文 (2016);使用该实验方案发表的文章:Xu等,2018。
参考文献
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