果蝇幼虫唾液腺组织中线粒体荧光蛋白标记观察   

材料与试剂

1. 培养皿
2. 载玻片和盖玻片
3. (可选) 过滤灭菌器
4. EP管
5. 锡箔纸
6. 果蝇样本
7. 甘油
8. 指甲油
9. NaCl
10. KCl
11. Na₂HPO₄
12. KH₂PO₄
13. HCl
14. 多聚甲醛
15. 1× PBS缓冲液 (见溶液配方)
16. 4% PFA溶液 (见溶液配方)
17. DAPI母液 (20 ng/μl) (见溶液配方)
18. 0.1 M磷酸钠缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 解剖镊
2. (可选) 高压蒸汽灭菌锅 
3. -20 °C冰箱
4. 激光共聚焦显微镜或者荧光显微镜 (Leica, model: Leica SP8)
   

实验步骤

1. 将带有sqh-EYFP-Mito的果蝇亲本 (BL7194) 与待检测的果蝇亲本杂交；幼虫在实验条件下饲养到三龄幼虫Wandering时期。
   注：若用UAS-GFP，购买BDSC果蝇编号为BL8442。实验条件温度若无GAL4系统则用25 °C培养，若用UAS-GAL4系统，则用29 °C培养。
   
2. 在PBS缓冲液中用解剖镊解剖三龄幼虫分离唾液腺组织；将组织放置于含有PBS缓冲液的染色皿中。
3. 吸干PBS缓冲液，用4%多聚甲醛 (PFA) 在室温下固定30 min。
4. 吸干PFA溶液，用PBS清洗3次。每次10 min。
5. 按照1:10稀释20 ng/μl DAPI母液，并染色5 min。
6. 吸走DAPI，用PBS清洗3次。
7. 80%甘油压片，用指甲油封片。
8. 用激光共聚焦显微镜或者荧光显微镜扫描样品 (图1)。检测光谱为EYFP检测光谱，激发光488 nm波长。
   
   
   图1. 果蝇唾液腺细胞mito-EYFP
   

溶液配方

1. 1× PBS缓冲液
   137 mM NaCl
   2.7 mM KCl
   10 mM Na₂HPO₄
   2 mM KH₂PO₄
   用800 ml蒸馏水溶解8 g NaCl，0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4 和0.24 g KH₂PO₄。用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1 L。分装后在15 psi (1.05 kg/cm²) 高压蒸汽灭菌20 min，或通过过滤除菌，保存至室温
2. 4% PFA
   10 g多聚甲醛溶解在0.1 M磷酸钠缓冲液 (250 ml)，加热60 °C搅拌至澄清，调整pH到7.4
   
3. DAPI母液
   1 mg/ml
   10 mg DAPI粉末加入100 ml双蒸水中配置成1 mg/ml母液，分装在10个EP管中，用锡箔纸包裹，置于-20 °C冰箱保存。实际使用时，将母液1:5,000稀释
4. 0.1 M磷酸钠缓冲液
   3.0 g NaH₂PO₄, 14.2 g Na₂HPO₄，溶解到1,250 ml蒸馏水中
   

参考文献

1. LaJeunesse, D. R., Buckner, S. M., Lake, J., Na, C., Pirt, A. and Fromson, K. (2004). Three new Drosophila markers of intracellular membranes. Biotechniques 36(5): 784-788, 790.