果蝇视网膜电图记录   

材料与试剂

1. 双面胶带
2. 单面胶带
3. 6 cm × 5 cm × 2 cm的塑料板
4. 硼硅玻璃毛细管 (World Precision Instruments, catalog number: 1B100-4，批号：2009326)
5. 微量上样枪头0.5~10 μl (Eppendorf，批号：E273231P)
6. 1 ml无菌注射器 (江苏客乐医用器械有限公司)
7. 离心管 (海门臣星实验器材经营部，规格：1.5 ml)
8. 培养皿 (直径：35 mm) (康宁，catalog number: 430165)
9. 1~3日龄的果蝇
10. 林格氏溶液 (见溶液配方)
    氯化钠 (NaCl) (Sigma-Aldrich, catalog number: 746398)
    氯化钾 (KCl) (Sigma-Aldrich, catalog number: P4504)
    二水氯化钙 (CaCl₂·2H₂O) (Sangon Biotech, catalog number: C0556)
    碳酸氢钠 (NaHCO₃) (Sigma-Aldrich, catalog number: S5761)
    酚红 (南京助研生物技术有限公司，CAS: 143-74-80)
11. 导电溶液 (见溶液配方)
    导电膏 (Parker Laboratories，批号：REF 17-05，容量：5盎司)
    林格氏溶液
    

仪器设备

1. 避光布 (图1)
   
   
   图1. 视网膜电位记录装置
   
   
2. 镊子 (中镜科仪，catalog number: EZ5889B)
3. 电子快门控制器 (Newport) (图2)
4. 轴突数据采集系统 (Molecular Devices, model: 1550B) (图2)
5. 细胞内静电计 (Warner Instruments, model: IE-210) (图2)
6. 供电系统 (Newport, model: 68938) (图3)
7. 钨灯 (飞利浦，model: 409850) (图3)
8. 热过滤器 (Newport, model: 60008) (图3)
9. 聚光镜 (Newport, model: 76992) (图3)
10. 光纤 (Newport, model: 40230) (图3)
11. 电脑 (联想，model: L195wD)
12. 显微镜 (尼康，model: SMZ800)
13. 玻璃管电极2个 (Warner Instruments, model: 64-0964) (图4和图5)
14. 三轴精细机械显微操纵器2个 (Narishige, model: TM-1; Sarasota, model: KITE-R) (图4)
15. 电极夹1个 (Warner Instruments) (图4)
16. 拉针仪 (Sutter Instrument, model: P-97)
    
    
    图2. 电生理记录设备
    
    
    图3. 刺激光源装置
    
    
    图4. 果蝇视网膜电位记录台
    
    
    图5. 玻璃电极和毛细管

软件

电信号处理软件：

1. Clampfit10.6
2. Clampex10.6
3. AxoScope10.6

实验步骤

1. 拉针：将拉针仪的程序设定为：加热625，拉力85，速度78，时间98。此时拉出来的玻璃毛细管的椎体长度约为4 mm，尖端为1~3 μm，电阻为1~10 MΩ。
2. 将微量上样枪头剪短，细长部分套在1 ml无菌注射器的针头上，用来吸取培养皿内的林格氏溶液，再将溶液注入玻璃电极和拉好的玻璃毛细管，拧好以后，将参比电极和记录电极固定在左右三轴精细机械微操纵器上。为防止毛细管溶液蒸发，在未开始实验前，将两个毛细管浸没在用培养皿盛放的林格氏溶液里。(图4和图5)
3. 挑选1~3日龄的果蝇，用镊子夹住果蝇翅膀，将果蝇翅膀轻轻粘在双面胶上，并使其身体倾斜45°左右，完整露出一侧复眼。操作过程中注意不要触碰到复眼，以保持复眼的完好。最后用单面胶带固定住果蝇腹部，这样既可以保证复眼结构完整，又能够避免果蝇在实验过程中颤动。(图6)
   
   
   图6. 固定果蝇示意图
   
   
4. 将固定的果蝇放置在显微镜底下。在显微镜视野范围内，利用使用过的玻璃毛细管沾取少量导电溶液均匀涂抹于果蝇整个复眼表面及其靠近单面胶带上面位置的背部，使得复眼和背部变得透亮即可。此时应注意导电溶液的涂抹量，过少的导电溶液在实验过程中容易干掉，过多的导电溶液则会使果蝇的复眼和背部连通，都会使得电信号的获取无法顺利进行。
5. 通过操控三轴精细机械显微操纵器将参比电极轻轻搭在果蝇背部涂有导电溶液的位置，记录电极轻放在果蝇复眼表面。注意放电极的力度，要让果蝇复眼和背部都处于自然状态，尽量不要有凹陷，才能保证果蝇状态正常，这样记录的电信号结果才会更加稳定。(图7)
   
   
   图7. 置放电极示意图
   
   
6. 最后让果蝇暗适应5 min，再开始记录果蝇的视网膜电位。先运行程序10 s，随后给果蝇一个5 s的光刺激，光强为400 lux，再让果蝇暗适应10 s，随后再次给一个5 s的刺激，循环记录两次。(图8)
   
   
   图8. 野生型果蝇视网膜电图
   
   
7. 每个基因型的果蝇测12只以上。电位记录分析软件为AxoScope10.6与Clamfit10.6，统计实验结果并进行分析。
   

溶液配方

1. 林格氏溶液
   NaCl 8.6 g/L
   CaCl₂·2H₂O 0.33 g/L
   KCl 0.3 g/L
   NaHCO₃ 4 g/L
   酚红 (少量，作为pH指示剂)
2. 导电溶液 (存放于1.5 ml离心管)
   导电膏600 μl
   林格氏溶液600 μl

致谢

此实验方法是基于实验室胡雯 (Hu等, 2015) 已发表的论文进行的拓展和细化。

参考文献

1. Hu, W., Wang, T., Wang, X. and Han, J. (2015). I_h channels control feedback regulation from amacrine cells to photoreceptors. PLoS Biol 13(4): e1002115.