摘要:EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) 是一种胸腺嘧啶类似物,能够在DNA复制时代替胸腺嘧啶T插入正在合成的分子中,后续再通过显色,标记出正在进行DNA复制的细胞,是一种很好的检测细胞增殖能力的方法。与其他抗体的共染,达到了其他蛋白与增殖细胞共同标记的目的。果蝇幼虫的翅成虫盘(wing imaginal disc)由高度增殖的上皮细胞组成,解剖方便,是研究生长发育的很经典的组织模型 (Cohen,1993;Beira和Paro,2016)。
关键词: 果蝇翅成虫盘, EdU, 免疫荧光染色
材料与试剂
仪器设备
实验步骤
一、EdU标记 先在解剖板中加入适量的SD溶液,取适量 (5~20只,依操作者熟练程度和实验需求wing disc数而定) 特定基因型的三龄果蝇幼虫置于解剖板中,使幼虫被SD培养液完全浸润,进行快速粗解剖。在幼虫前1/3处截断幼虫,丢弃其余尾部2/3的部分,取下带有wing disc的头部1/3组织,使用镊子小心翻转组织,类似于内外翻转手套或者袜子的样子,使其外皮翻入内侧,而内脏翻到外侧,置于含有SD培养液的600 μl EP管中,待收集足够只数的头部1/3组织,按1:1,000加入EdU (A溶液,试剂盒提供),常温在滚轴上滚动EP管,作用30 min。 注:解剖快速,解剖液必须是能保持果蝇组织离体后仍可以继续生长的培养液,EdU作用时间也要严格控制。 二、固定组织
三、免疫荧光染色
四、EdU显色
五、制片与观察
结果与分析
如图1所示为en-Gal4>UAS-GFP的三龄幼虫翅成虫盘,EdU与GFP,CI共染结果。GFP标记翅成虫盘posterior区域,CI标记翅成虫盘anterior区域,EdU标记S期细胞。 图1. 翅成虫盘细胞EdU标记. 图为果蝇三龄幼虫翅成虫盘结构,基因型为:en-Gal4>UAS-GFP。蓝色DAPI标记DNA,白色为anti-CI染色,绿色为GFP,即Gal4表达位置,红色为EdU标记。标尺:50 μm。
失败经验
溶液配方
致谢
本实验方法参考已发表文章 (Deng等,2016) 中的实验方法。基金支持来自国家自然科学基金面上项目31371319。在此一同表示感谢。
参考文献
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