果蝇幼虫翅成虫盘的EdU标记和免疫荧光染色   

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Original research article

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Rice Protocol e-book

 

摘要:EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) 是一种胸腺嘧啶类似物,能够在DNA复制时代替胸腺嘧啶T插入正在合成的分子中,后续再通过显色,标记出正在进行DNA复制的细胞,是一种很好的检测细胞增殖能力的方法。与其他抗体的共染,达到了其他蛋白与增殖细胞共同标记的目的。果蝇幼虫的翅成虫盘(wing imaginal disc)由高度增殖的上皮细胞组成,解剖方便,是研究生长发育的很经典的组织模型 (Cohen,1993;Beira和Paro,2016)。

关键词: 果蝇翅成虫盘, EdU, 免疫荧光染色

材料与试剂

  1. 各种规格枪头 (配套移液枪)
  2. 各种规格EP管
  3. 载破片
  4. 盖破片
  5. 三龄果蝇幼虫
  6. NaCl (国药沪试,catalog number: 10019318)
  7. KCl (生工,catalog number: PB0440)
  8. Na2HPO4 (生工,catalog number: S0404)
  9. KH2PO4 (生工,catalog number: PB0445)
  10. Schneider昆虫培养基 (Sigma, catalog number: S9895)
  11. 8% PFA溶液 (8% Paraformaldehyde aqueous solution) (Electron MicroscopySciences, catalog number: 157-8)
  12. Triton X-100 (生工,catalog number: A110694-0100)
  13. Bovine serum albumin (BSA) (生工,catalog number: A600332-0100)
  14. 一抗
  15. 荧光二抗
  16. DAPI (Sigma, catalog number: D9542)
  17. 抗淬灭剂:VECTASHIELD® Antifade Mounting Medium (VECTOR, catalog number: H-1000)
  18. ddH2O
  19. Click-iTTM EdU Alexa FluorTM 555 Imaging Kit (Invitrogen, catalog number: C10338)
  20. 1× PBS, pH 7.4 (见溶液配方)
  21. SD溶液 (见溶液配方)
  22. 4% PFA溶液 (见溶液配方)
  23. 0.1% PBT (见溶液配方)
  24. 0.5% PBT (见溶液配方)
  25. 3% BSA blocking buffer (见溶液配方)
  26. Click-iTTM EdU Alexa FluorTM 555 Imaging Kit (见溶液配方)
  27. DAPI溶液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 剪刀
  2. 体式显微镜 (Nikon)
  3. 精细解剖镊× 2
  4. 解剖板
  5. 各量程移液枪
  6. 滚轴 (海门市其林贝尔仪器制造公司,SRT-202滚轴式混合器)
  7. 激光共聚焦显微镜 (Olympus, FV1000)

实验步骤

一、EdU标记
先在解剖板中加入适量的SD溶液,取适量 (5~20只,依操作者熟练程度和实验需求wing disc数而定) 特定基因型的三龄果蝇幼虫置于解剖板中,使幼虫被SD培养液完全浸润,进行快速粗解剖。在幼虫前1/3处截断幼虫,丢弃其余尾部2/3的部分,取下带有wing disc的头部1/3组织,使用镊子小心翻转组织,类似于内外翻转手套或者袜子的样子,使其外皮翻入内侧,而内脏翻到外侧,置于含有SD培养液的600 μl EP管中,待收集足够只数的头部1/3组织,按1:1,000加入EdU (A溶液,试剂盒提供),常温在滚轴上滚动EP管,作用30 min。
注:解剖快速,解剖液必须是能保持果蝇组织离体后仍可以继续生长的培养液,EdU作用时间也要严格控制。
    
二、固定组织

  1. SD培养液清洗两次,每次5 min。
    注:在本步及之后的所有洗涤,反应步骤中请注意,需要EP管在滚轴上滚动进行,移液时可使EP管正立于EP管架上,静置小段时间使组织自然沉底,再使用200 μl的移液枪小心地移去上方液体 (可以留有残余液体,首先保证不要戳到或吸走组织),留下组织,再加入所述对应的溶液。
  2. 4% PFA溶液固定组织15~20 min。(通风橱操作)
  3. 0.1% PBT快洗三次。(通风橱操作)
    注:快洗即每次只需上下轻柔翻转EP管2次。
  4. 于滚轴上0.1% PBT慢洗三次,每次10 min。

三、免疫荧光染色

  1. 3% BSA blocking buffer封闭30 min。
    注:封闭的作用是减少后续步骤中抗体的非特异性结合。
  2. 吸走blocking buffer,加入一抗 (按比例用3% BSA blocking buffer稀释) 孵育,4 °C过夜或常温4 h,一抗可以回收再利用。
  3. 0.1% PBT慢洗三次,每次10 min。
  4. 加入荧光二抗 (按比例用3% BSA blocking buffer稀释),常温1h30min。
    注:此处选择CY3以外的荧光二抗,切忌与EdU kit荧光相同,此后步骤均要注意避光操作。
  5. 1:2,000加入DAPI (0.1% PBT稀释),作用20 min。
  6. 0.1% PBT慢洗三次,每次10 min。

四、EdU显色

  1. 0.5% PBT作用15~20 min。
    注:此处应严格控制时间,避免过强的通透作用破坏细胞自发荧光。
  2. 3% BSA blocking buffer清洗两次,每次5 min。
  3. 加入EdU显色反应液,常温反应30 min,在滚轴上滚动。
    注:显色反应液试剂盒提供,现用现配,避光操作:1× D溶液430 μl,E溶液20 μl,B溶液1.2 μl,1× F溶液50 μl,充分混合,共501.2 μl。
  4. 3% BSA blocking buffer清洗两次,每次5 min。
  5. 0.1% PBT慢洗三次,每次10 min。
  6. 抗淬灭剂中保存组织,浸没组织即可,4 °C避光保存。

五、制片与观察

  1. 待抗淬灭剂浸透组织后 (通常4 °C过夜),用剪掉最尖端部分的200 μl黄枪头,作为吸管小心吸取EP管内幼虫组织到载玻片上,使用细解剖镊将wing disc单独解剖出来制片,盖玻片盖片。
  2. 激光共聚焦显微镜观察,拍照。

结果与分析

如图1所示为en-Gal4>UAS-GFP的三龄幼虫翅成虫盘,EdU与GFP,CI共染结果。GFP标记翅成虫盘posterior区域,CI标记翅成虫盘anterior区域,EdU标记S期细胞。


图1. 翅成虫盘细胞EdU标记. 图为果蝇三龄幼虫翅成虫盘结构,基因型为:en-Gal4>UAS-GFP。蓝色DAPI标记DNA,白色为anti-CI染色,绿色为GFP,即Gal4表达位置,红色为EdU标记。标尺:50 μm。

失败经验

  1. 组织的自发荧光可能会遭到一定程度的破坏,如果有自发GFP,建议用chicken anti-GFP的一抗将GFP再染一次。
  2. EdU标记与显色时,保证每个组织细胞都均匀的与溶液接触,即样品要在滚轴上滚动并严格控制时间。
  3. Invitrogen公司提供不同荧光的kit,切忌kit荧光与所染抗体荧光相同,F溶液易变质,变黄则变质,所以要分装小管,避免反复冻融。
  4. 注意避光操作,防止荧光淬灭。

溶液配方

  1. 1× PBS (pH 7.4)
    137 mM NaCl
    2.7 mM KCl
    10 mM Na2HPO4
    2 mM KH2PO4
  2. SD溶液
    购买Schneider昆虫培养基 (Sigma, S9895),按公司提供protocol配制培养液
  3. 4% PFA溶液
    8% PFA用1× PBS稀释为4% PFA,常温保存
  4. 0.1% PBT
    0.1% Triton X-100 in 1× PBS,常温保存
  5. 0.5% PBT
    0.5%Triton X-100 in 1× PBS,常温保存
  6. 3% BSA blocking buffer
    3% BSA in 0.1% PBT,4 °C保存
  7. Click-iTTM EdU Alexa FluorTM 555 Imaging Kit (Invitrogen, C10338)
    此试剂盒提供A-G试剂,按照说明将粉末溶解为液体:
    A溶液:EdU(A) 5 mg粉末,加入2 ml DMSO (C) 溶解,分装,-20 °C保存,保质期一年
    B溶液:Alexa FluorTM azide (B) 加入70 μl DMSO (C) 溶解,-20 °C避光保存,保质期一年
    C溶液:DMSO
    D溶液:10× Click-iTTM EdU reaction buffer,4 °C保存,用时ddH2O稀释为1×,保质期半年
    E溶液:CuSO4溶液, 4 °C保存
    F溶液:Click-iTTM EdU buffer additive (F) 400 mg粉末,加入2 ml ddH2O溶解后为10× F,分装,避免反复冻融,-20 °C保存,保质期一年,用时ddH2O稀释为1×
    G溶液:Hoechst 33342 (选用)
  8. DAPI溶液
    DAPI粉末加ddH2O加热溶解配制为20 mg/ml stock,分装,-20 °C避光保存,按1:2,000比例使用

致谢

本实验方法参考已发表文章 (Deng等,2016) 中的实验方法。基金支持来自国家自然科学基金面上项目31371319。在此一同表示感谢。

参考文献

  1. Beira, J. V. and Paro, R. (2016). The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma 125(4): 573-592.
  2. Cohen, S. (1993). Imaginal disc development. In: Bate, M. and Martinez-Arias, A. (Eds.). The development of Drosophila melanogaster. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  3. Deng, Q., Guo, T., Zhou, X., Xi, Y., Yang, X. and Ge, W. (2016). Cross-talk between mitochondrial fusion and the hippo pathway in controlling cell proliferation during Drosophila development. Genetics 203: 1777-1788.
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:苗晨, 杨小杭, 戈万忠. (2019). 果蝇幼虫翅成虫盘的EdU标记和免疫荧光染色. Bio-101: e1010277. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010277.
How to cite: Miao, C., Yang, X. H. and Ge, W. Z. (2019). EdU Labeling and Immunofluorescent Staining of Drosophila Larval Wing Imaginal Disc. Bio-101: e1010277. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010277.
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