果蝇幼虫翅成虫盘的EdU标记和免疫荧光染色   

材料与试剂

1. 各种规格枪头 (配套移液枪)
2. 各种规格EP管
3. 载破片
4. 盖破片
5. 三龄果蝇幼虫
6. NaCl (国药沪试，catalog number: 10019318)
7. KCl (生工，catalog number: PB0440)
8. Na₂HPO₄ (生工，catalog number: S0404)
9. KH₂PO₄ (生工，catalog number: PB0445)
10. Schneider昆虫培养基 (Sigma, catalog number: S9895)
11. 8% PFA溶液 (8% Paraformaldehyde aqueous solution) (Electron MicroscopySciences, catalog number: 157-8)
12. Triton X-100 (生工，catalog number: A110694-0100)
13. Bovine serum albumin (BSA) (生工，catalog number: A600332-0100)
14. 一抗
15. 荧光二抗
16. DAPI (Sigma, catalog number: D9542)
17. 抗淬灭剂：VECTASHIELD^® Antifade Mounting Medium (VECTOR, catalog number: H-1000)
18. ddH₂O
19. Click-iT^TM EdU Alexa Fluor^TM 555 Imaging Kit (Invitrogen, catalog number: C10338)
20. 1× PBS, pH 7.4 (见溶液配方)
21. SD溶液 (见溶液配方)
22. 4% PFA溶液 (见溶液配方)
23. 0.1% PBT (见溶液配方)
24. 0.5% PBT (见溶液配方)
25. 3% BSA blocking buffer (见溶液配方)
26. Click-iT^TM EdU Alexa Fluor^TM 555 Imaging Kit (见溶液配方)
27. DAPI溶液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 剪刀
2. 体式显微镜 (Nikon)
3. 精细解剖镊× 2
4. 解剖板
5. 各量程移液枪
6. 滚轴 (海门市其林贝尔仪器制造公司，SRT-202滚轴式混合器)
7. 激光共聚焦显微镜 (Olympus, FV1000)
   

实验步骤

一、EdU标记
先在解剖板中加入适量的SD溶液，取适量 (5~20只，依操作者熟练程度和实验需求wing disc数而定) 特定基因型的三龄果蝇幼虫置于解剖板中，使幼虫被SD培养液完全浸润，进行快速粗解剖。在幼虫前1/3处截断幼虫，丢弃其余尾部2/3的部分，取下带有wing disc的头部1/3组织，使用镊子小心翻转组织，类似于内外翻转手套或者袜子的样子，使其外皮翻入内侧，而内脏翻到外侧，置于含有SD培养液的600 μl EP管中，待收集足够只数的头部1/3组织，按1:1,000加入EdU (A溶液，试剂盒提供)，常温在滚轴上滚动EP管，作用30 min。
注：解剖快速，解剖液必须是能保持果蝇组织离体后仍可以继续生长的培养液，EdU作用时间也要严格控制。
    
二、固定组织

1. SD培养液清洗两次，每次5 min。
   注：在本步及之后的所有洗涤，反应步骤中请注意，需要EP管在滚轴上滚动进行，移液时可使EP管正立于EP管架上，静置小段时间使组织自然沉底，再使用200 μl的移液枪小心地移去上方液体 (可以留有残余液体，首先保证不要戳到或吸走组织)，留下组织，再加入所述对应的溶液。
   
2. 4% PFA溶液固定组织15~20 min。(通风橱操作)
3. 0.1% PBT快洗三次。(通风橱操作)
   注：快洗即每次只需上下轻柔翻转EP管2次。
   
4. 于滚轴上0.1% PBT慢洗三次，每次10 min。
   
   

三、免疫荧光染色

1. 3% BSA blocking buffer封闭30 min。
   注：封闭的作用是减少后续步骤中抗体的非特异性结合。
   
2. 吸走blocking buffer，加入一抗 (按比例用3% BSA blocking buffer稀释) 孵育，4 °C过夜或常温4 h，一抗可以回收再利用。
3. 0.1% PBT慢洗三次，每次10 min。
4. 加入荧光二抗 (按比例用3% BSA blocking buffer稀释)，常温1h30min。
   注：此处选择CY3以外的荧光二抗，切忌与EdU kit荧光相同，此后步骤均要注意避光操作。
   
5. 1:2,000加入DAPI (0.1% PBT稀释)，作用20 min。
6. 0.1% PBT慢洗三次，每次10 min。
   
   

四、EdU显色

1. 0.5% PBT作用15~20 min。
   注：此处应严格控制时间，避免过强的通透作用破坏细胞自发荧光。
   
2. 3% BSA blocking buffer清洗两次，每次5 min。
3. 加入EdU显色反应液，常温反应30 min，在滚轴上滚动。
   注：显色反应液试剂盒提供，现用现配，避光操作：1× D溶液430 μl，E溶液20 μl，B溶液1.2 μl，1× F溶液50 μl，充分混合，共501.2 μl。
   
4. 3% BSA blocking buffer清洗两次，每次5 min。
5. 0.1% PBT慢洗三次，每次10 min。
6. 抗淬灭剂中保存组织，浸没组织即可，4 °C避光保存。
   
   

五、制片与观察

1. 待抗淬灭剂浸透组织后 (通常4 °C过夜)，用剪掉最尖端部分的200 μl黄枪头，作为吸管小心吸取EP管内幼虫组织到载玻片上，使用细解剖镊将wing disc单独解剖出来制片，盖玻片盖片。
2. 激光共聚焦显微镜观察，拍照。
   

结果与分析

如图1所示为en-Gal4>UAS-GFP的三龄幼虫翅成虫盘，EdU与GFP，CI共染结果。GFP标记翅成虫盘posterior区域，CI标记翅成虫盘anterior区域，EdU标记S期细胞。


图1. 翅成虫盘细胞EdU标记. 图为果蝇三龄幼虫翅成虫盘结构，基因型为：en-Gal4>UAS-GFP。蓝色DAPI标记DNA，白色为anti-CI染色，绿色为GFP，即Gal4表达位置，红色为EdU标记。标尺：50 μm。

失败经验

1. 组织的自发荧光可能会遭到一定程度的破坏，如果有自发GFP，建议用chicken anti-GFP的一抗将GFP再染一次。
2. EdU标记与显色时，保证每个组织细胞都均匀的与溶液接触，即样品要在滚轴上滚动并严格控制时间。
3. Invitrogen公司提供不同荧光的kit，切忌kit荧光与所染抗体荧光相同，F溶液易变质，变黄则变质，所以要分装小管，避免反复冻融。
4. 注意避光操作，防止荧光淬灭。
   

溶液配方

1. 1× PBS (pH 7.4)
   137 mM NaCl
   2.7 mM KCl
   10 mM Na₂HPO₄
   2 mM KH₂PO₄
2. SD溶液
   购买Schneider昆虫培养基 (Sigma, S9895)，按公司提供protocol配制培养液
   
3. 4% PFA溶液
   8% PFA用1× PBS稀释为4% PFA，常温保存
   
4. 0.1% PBT
   0.1% Triton X-100 in 1× PBS，常温保存
   
5. 0.5% PBT
   0.5%Triton X-100 in 1× PBS，常温保存
   
6. 3% BSA blocking buffer
   3% BSA in 0.1% PBT，4 °C保存
   
7. Click-iT^TM EdU Alexa Fluor^TM 555 Imaging Kit (Invitrogen, C10338)
   此试剂盒提供A-G试剂，按照说明将粉末溶解为液体：
   A溶液：EdU(A) 5 mg粉末，加入2 ml DMSO (C) 溶解，分装，-20 °C保存，保质期一年
   B溶液：Alexa Fluor^TM azide (B) 加入70 μl DMSO (C) 溶解，-20 °C避光保存，保质期一年
   C溶液：DMSO
   D溶液：10× Click-iT^TM EdU reaction buffer，4 °C保存，用时ddH₂O稀释为1×，保质期半年
   E溶液：CuSO₄溶液, 4 °C保存
   F溶液：Click-iT^TM EdU buffer additive (F) 400 mg粉末，加入2 ml ddH₂O溶解后为10× F，分装，避免反复冻融，-20 °C保存，保质期一年，用时ddH₂O稀释为1×
   G溶液：Hoechst 33342 (选用)
8. DAPI溶液
   DAPI粉末加ddH₂O加热溶解配制为20 mg/ml stock，分装，-20 °C避光保存，按1:2,000比例使用
   

致谢

本实验方法参考已发表文章 (Deng等，2016) 中的实验方法。基金支持来自国家自然科学基金面上项目31371319。在此一同表示感谢。

参考文献

1. Beira, J. V. and Paro, R. (2016). The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma 125(4): 573-592.
2. Cohen, S. (1993). Imaginal disc development. In: Bate, M. and Martinez-Arias, A. (Eds.). The development of Drosophila melanogaster. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
3. Deng, Q., Guo, T., Zhou, X., Xi, Y., Yang, X. and Ge, W. (2016). Cross-talk between mitochondrial fusion and the hippo pathway in controlling cell proliferation during Drosophila development. Genetics 203: 1777-1788.