Guideline for Using in vivo RNAi Libraries of Drosophila   

材料与试剂

1. 提供RNAi品系的果蝇中心：
   Vienna Drosophila Resource Center (VDRC): https://stockcenter.vdrc.at
   Transgenic RNAi Project (TRiP): https://fgr.hms.harvard.edu/fly-in-vivo-rnai
   National Institute of Genetics in Japan (NIG-FLY): https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly
   TsingHua Fly Center (THFC): http://fly.redbux.cn

实验步骤

一、RNAi文库介绍

1. VDRC果蝇中心
   维也纳的VDRC果蝇中心由Barry Dickson开创，其RNAi文库有着最高的基因组覆盖率，包括针对12,671个 (91%) 蛋白编码基因的26,957个转基因RNAi品系，由GD文库、KK文库、和shRNA文库组成。
         GD文库在2007年公布 (Dietzl等，2007)，将长反转重复序列 (平均长度为321 bp) 构建到UAS载体中，采用w+作为标记，并通过P-element随机插入至X, 2, 或3号染色体中。GD文库包含16,763个果蝇品系，针对11,292个 (81%)蛋白编码基因。由于RNAi载体的插入位点是随机的，它们在基因组中的位置会影响其表达水平，从而影响基因敲低的效率。据VDRC估计，超过80%的GD品系能够提供有效的基因特异性沉默。另一个必须注意的问题是RNAi的脱靶效应 (off-target)。长双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 被加工成许多siRNA而发挥沉默效果，目前尚无法精确预测每个dsRNA所有的脱靶效应。尽管如此，GD文库被成功地应用于多个全基因组或大规模体内RNAi筛选。
   2009年的KK文库在两个方面做了改进，首先它更新了目标序列设计以减少脱靶效应，其次它使用了基于phiC31的系统，预期将转基因定点插入于2号染色体40D3的attP-VIE-260B，从而消除位置效应。KK文库仍然使用长反转重复序列(平均长度为357 bp)，包括了针对9,646个 (69%) 基因的9,822个品系，是GD文库的有益补充。然而研究表明，KK文库实际上有2个基因组整合位点，最初预期的40D3和实际位点30B3。在75%的KK品系中，RNAi载体仅插入30B3位点，并且没有问题；在25%的KK品系中，RNAi载体也插入40D3位点，并且与一些Gal4杂交时出现非特异性表型。因此在使用KK文库时一定要注意所观察到的表型是否属于假阳性，详情请参考https://stockcenter.vdrc.at/control/library_rnai中的KK library-landing site information以及文献 (Green等，2014；Vissers等，2016)。
          由于短链hairpin RNA (shRNA) 较长链dsRNA具有更多优点 (见下文)，VDRC从2016开始构建shRNA文库。该文库使用TRiP的WALIUM20载体，并全部整合于2号染色体的attP40位点，唯一的区别是WALIUM20采用w+作为选择标记，而TRiP所有的品系都使用v+作为选择标记。目前该文库已包括726个品系，并且还在陆续增加中，该文库所选择的hairpin序列靶向mRNA序列的不同区域而且独立于其它所有RNAi文库。
2. 哈佛医学院TRiP果蝇中心
   自2008年以来，Norbert Perrimon领导的哈佛大学医学院果蝇中心不断地优化转基因RNAi方法并构建了TRiP文库 (Perkins等，2015)。目前TRiP文库包括了超过13,000个RNAi品系，覆盖了80%以上的蛋白编码基因，所有TRiP生产的果蝇品系都通过Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) 立即公开提供给社区使用。
          TRiP使用一系列称为VALIUM的载体，并通过phiC31系统整合到二号染色体的attP40或三号染色体的attP2位点。由于担心white基因(w)的剂量在行为研究中的影响，所有VALIUM载体都使用vermillion (朱红眼, v) 作为选择标记。值得当心的是，将TRiP RNAi品系与w突变体背景的果蝇杂交产生的后代会出现各种眼睛颜色。
          第一代VALIUM载体包括VALIUM1和VALIUM10，它们都导致400~600 bp的长链dsRNA的表达。VALIUM1的敲低效果相对较弱，而VALIUM10由于在hairpin两侧加了gypsy绝缘子，导致敲低效率提高；但两者在生殖细胞中的效果都不理想。第二代VALIUM载体VALIUM20和VALIUM22采用了短hairpin的shRNA设计，将21bp的靶向序列嵌入micro-RNA(miR-1)的骨架中。由于hairpin较短，这些shRNA品系可能比长链dsRNA品系具有更少的脱靶效应；同时由于shRNA被大量产生，它们比dsRNA品系具有更强的敲低效果。VALIUM22含有UASp启动子因此只适合于生殖细胞表达，而VALIUM20对体细胞和生殖细胞都取得了极好的敲低效果 (Ni等，2011)。所以VALIUM20是目前果蝇体内RNAi的最佳载体，占了TRiP文库中超过70%的品系。目前TRiP新构建的RNAi品系也都基于VALIUM20，而VDRC新构建的品系则使用类似的WALIUM20载体。尽管如此，并不是所有的VALIUM20 RNAi品系都起作用，一部分RNAi品系，特别是针对基因3’UTR区域的，不能产生有效的敲低效果 (Perkins等，2015)。
3. 日本NIG果蝇中心
   从2005年开始，Ryu Ueda领导的日本National Institute of Genetics (NIG) 果蝇中心逐渐构建了包含12,389个果蝇品系的NIG-RNAi文库 (> 50%基因组覆盖率)。与VDRC的GD文库类似，这些品系采用长链dsRNA设计，以w+作为选择标记，并通过P-element随机整合到基因组中。注意少量NIG-RNAi品系被白眼果蝇污染，因此使用前要检查它们的眼睛颜色。此外，与TRiP合作，NIG现在也提供5,958个基于VALIUM20和22的shRNA品系，其中绝大部分与TRiP的品系相同。
   
4. 清华大学果蝇中心
   倪建泉教授领导的清华大学果蝇中心 (TsingHua Fly Center, THFC) 成立于2011年，包含VALIUM系列的超过8,000个RNAi品系，其中大部分与TRiP的品系相同，然而有一部分是TRiP和BDSC所没有的。此外，THFC还维护着200个常用的Gal4品系；并提供构建新的shRNA RNAi品系的服务。
   
   

二、RNAi品系挑选

通过Flybase输入想要研究的基因名称，到达基因页面，点入Stock Availability，查看可以订购的果蝇品系：其中VDRC的RNAi品系名称里面包括GD, KK, 或VSH。TRiP品系名称中包含TRiP，以JF开头的可能基于VALIUM1或VALIUM10载体；以HM开头的基于VALIUM10载体；以HMS, HMC, HMJ开头的都基于VALIUM20载体；以GL开头的基于VALIUM22载体。
       清华大学果蝇中心和日本NIG果蝇中心的RNAi品系没有整合到Flybase数据库中，因此需要到相应网站进行搜索。此外，可以到各个果蝇中心下载所有RNAi品系的列表，里面有hairpin设计和目标序列的详细信息。

三、Gal4品系使用
由于所有果蝇RNAi文库都基于UAS载体，它们必须与Gal4品系杂交才能发挥作用。全身性的敲低一般使用Actin5C-或Tubulin-Gal4，常见的组织特异性的Gal4包括Mef2-Gal4 (肌肉)，elav-Gal4 (神经元)，nanos-Gal4 (生殖细胞)，ey-Gal4 (眼睛)，nubbin-Gal4 (翅膀)，ppl-Gal4 (脂肪体)，myo1A-Gal4 (肠道)。RNAi实验一般在25~29 °C进行，由于Gal4的活性受温度影响，因此更高的温度会提高RNAi效率。
      另一个增强RNAi效果的方法是过表达Dicer2 (Dcr2)。由于Dcr2处理长链dsRNA，但不处理短链shRNA，因此Dcr2只对基于长dsRNA的文库有效，例如VDRC GD, KK, NIG-RNAi, TRiP VALIUM1和VALIUM10。常用的GAL4已经和UAS-Dcr2重组在一起以利于使用，例如TRiP toolbox fly stocks (https://fgr.hms.harvard.edu/trip-toolbox) 所列出的。这些品系，以及在X, 2, 或3号染色体单独的UAS-Dcr2果蝇都可以从BDSC, VDRC或清华果蝇中心订购。此外，TRiP和VDRC还提供了可以用于实验对照的背景果蝇和RNAi品系 (https://fgr.hms.harvard.edu/trip-rnai-control-fly-stocks)。

结果与分析

对于RNAi实验而言，最重要的是需要对其敲低的表型进行验证，可以采用下面几个方法。

1. 检测敲低的效率
   RNAi品系敲低的效率可以通过检测所对应的蛋白或mRNA水平的降低。如果有靶蛋白的抗体，可以通过免疫组化或Western Blot确定敲低效率；如果没有对应抗体，则只能通过qPCR测量mRNA水平的降低。总的来说，蛋白质水平上的测试比mRNA水平的测试更加可靠。
   
2. 使用独立的RNAi品系
   由于针对不同序列的hairpin不太可能出现相同的脱靶效应，因此最简单的办法是使用多个独立的，针对非重叠区域的RNAi品系验证同一表型。注意不同的RNAi品系可能含有相同的hairpin，因此不属于独立的RNAi品系，例如有些VALIUM20和VALIUM22使用同样的shRNA序列。从Flybase基因的JBrowse可以很方便地看到每个RNAi所针对的序列。如果没有额外的RNAi品系，则需要使用相应文库的载体自己克隆并构建新的RNAi品系。
   
3. 采用sgRNA验证RNAi表型
   最终，RNAi所引起的表型可以通过分析遗传突变体进行确认，特别是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统。目前TRiP和NIG已经开始大规模构建转基因sgRNA品系，结合各种组织特异性表达的Cas9品系，sgRNA文库将是RNAi文库非常有益的补充。
   

致谢

严冬实验室的工作得到国家自然科学基金31771586，91857114，上海市科委17PJ1410300以及中国科学院的支持。

参考文献

1. Dietzl, G., Chen, D., Schnorrer, F., Su, K. C., Barinova, Y., Fellner, M., Gasser, B., Kinsey, K., Oppel, S., Scheiblauer, S., Couto, A., Marra, V., Keleman, K. and Dickson, B. J. (2007). A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature 448(7150): 151-156.
2. Green, E. W., Fedele, G., Giorgini, F. and Kyriacou, C. P. (2014). A Drosophila RNAi collection is subject to dominant phenotypic effects. Nat Methods 11(3): 222-223.
3. Ni, J. Q., Zhou, R., Czech, B., Liu, L. P., Holderbaum, L., Yang-Zhou, D., Shim, H. S., Tao, R., Handler, D., Karpowicz, P., Binari, R., Booker, M., Brennecke, J., Perkins, L. A., Hannon, G. J. and Perrimon, N. (2011). A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nat Methods 8(5): 405-407.
4. Perkins, L. A., Holderbaum, L., Tao, R., Hu, Y., Sopko, R., McCall, K., Yang-Zhou, D., Flockhart, I., Binari, R., Shim, H. S., Miller, A., Housden, A., Foos, M., Randkelv, S., Kelley, C., Namgyal, P., Villalta, C., Liu, L. P., Jiang, X., Huan-Huan, Q., Wang, X., Fujiyama, A., Toyoda, A., Ayers, K., Blum, A., Czech, B., Neumuller, R., Yan, D., Cavallaro, A., Hibbard, K., Hall, D., Cooley, L., Hannon, G. J., Lehmann, R., Parks, A., Mohr, S. E., Ueda, R., Kondo, S., Ni, J. Q. and Perrimon, N. (2015). The transgenic RNAi project at Harvard Medical School: resources and validation. Genetics 201(3): 843-852.
5. Vissers, J. H., Manning, S. A., Kulkarni, A. and Harvey, K. F. (2016). A Drosophila RNAi library modulates Hippo pathway-dependent tissue growth. Nat Commun 7: 10368.