摘要:目前RNAi是在果蝇体内对基因进行功能分析最有力的工具之一。该技术使用简单,只需要一步遗传杂交,即可实现组织和时间特异性的基因干扰。全基因组RNAi文库的开发使得转基因RNAi品系几乎涵盖了果蝇基因组中的每一个基因,并且使得大规模体内RNAi筛选成为可能。然而,目前共有四个果蝇中心可提供RNAi品系,每个中心的RNAi品系又基于不同的载体,因此为挑选和使用果蝇RNAi品系造成了一定难度。本文对各个果蝇中心的RNAi文库进行介绍,并为RNAi品系的使用提供指南。
关键词: 果蝇, RNAi, 体内筛选, Gal4-UAS
材料与试剂
实验步骤
一、RNAi文库介绍
二、RNAi品系挑选
通过Flybase输入想要研究的基因名称,到达基因页面,点入Stock Availability,查看可以订购的果蝇品系:其中VDRC的RNAi品系名称里面包括GD, KK, 或VSH。TRiP品系名称中包含TRiP,以JF开头的可能基于VALIUM1或VALIUM10载体;以HM开头的基于VALIUM10载体;以HMS, HMC, HMJ开头的都基于VALIUM20载体;以GL开头的基于VALIUM22载体。 清华大学果蝇中心和日本NIG果蝇中心的RNAi品系没有整合到Flybase数据库中,因此需要到相应网站进行搜索。此外,可以到各个果蝇中心下载所有RNAi品系的列表,里面有hairpin设计和目标序列的详细信息。 三、Gal4品系使用 由于所有果蝇RNAi文库都基于UAS载体,它们必须与Gal4品系杂交才能发挥作用。全身性的敲低一般使用Actin5C-或Tubulin-Gal4,常见的组织特异性的Gal4包括Mef2-Gal4 (肌肉),elav-Gal4 (神经元),nanos-Gal4 (生殖细胞),ey-Gal4 (眼睛),nubbin-Gal4 (翅膀),ppl-Gal4 (脂肪体),myo1A-Gal4 (肠道)。RNAi实验一般在25~29 °C进行,由于Gal4的活性受温度影响,因此更高的温度会提高RNAi效率。 另一个增强RNAi效果的方法是过表达Dicer2 (Dcr2)。由于Dcr2处理长链dsRNA,但不处理短链shRNA,因此Dcr2只对基于长dsRNA的文库有效,例如VDRC GD, KK, NIG-RNAi, TRiP VALIUM1和VALIUM10。常用的GAL4已经和UAS-Dcr2重组在一起以利于使用,例如TRiP toolbox fly stocks (https://fgr.hms.harvard.edu/trip-toolbox) 所列出的。这些品系,以及在X, 2, 或3号染色体单独的UAS-Dcr2果蝇都可以从BDSC, VDRC或清华果蝇中心订购。此外,TRiP和VDRC还提供了可以用于实验对照的背景果蝇和RNAi品系 (https://fgr.hms.harvard.edu/trip-rnai-control-fly-stocks)。
结果与分析
对于RNAi实验而言,最重要的是需要对其敲低的表型进行验证,可以采用下面几个方法。
致谢
严冬实验室的工作得到国家自然科学基金31771586,91857114,上海市科委17PJ1410300以及中国科学院的支持。
参考文献
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