果蝇幼虫脂滴的标记观察   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

 

摘要:脂滴是细胞内重要的细胞器,可以通过中性脂染料标记、观察其形态、大小与分布。

关键词: 果蝇幼虫, 脂滴, 染色

材料与试剂

  1. 载玻片
  2. 染色皿
  3. EP管
  4. 锡箔纸
  5. 果蝇幼虫
  6. 甘油
  7. 指甲油
  8. 1 mg/ml BODIPY494/503或0.5 mg/ml Nile red或LipidTOX母液
  9. NaCl 
  10. KCl 
  11. Na2PHO
  12. KH2PO
  13. HCl
  14. 多聚甲醛
  15. 磷酸钠缓冲液
  16. 双蒸水
  17. 丙酮
  18. DMSO或者无水乙醇
  19. 1× PBS缓冲液 (见溶液配方)
  20. 4% PFA溶液 (见溶液配方)
  21. 4%甲醇溶液 (见溶液配方)
  22. DAPI母液 (20 ng/μl) (见溶液配方)
  23. Nile Red (见溶液配方)
  24. BODIPY (见溶液配方)

仪器设备

  1. 解剖镊
  2. 高压蒸汽灭菌锅或过滤网
  3. -20 °C冰箱
  4. 激光共聚焦显微镜或蔡司荧光显微镜

实验步骤

  1. 幼虫在实验条件下饲养到三龄幼虫Wandering时期。
  2. 将适量PBS缓冲液滴于载玻片上,果蝇三龄幼虫置于液滴中。室温条件下,用解剖镊解剖,分离出脂肪体。将分离好的组织放于含有PBS缓冲液的染色皿中。
  3.  吸干PBS缓冲液,用4%多聚甲醛 (PFA) 在室温下固定30 min。
  4. 吸干PFA溶液,用PBS清洗3次,每次10 min。
  5. 根据需要,用PBS按1:1,000稀释1 mg/ml的中性脂染料BODIPY494/503或按1:2,500稀释0.5 mg/ml Nile red或按1:100稀释的LipidTOX。染料室温染色1小时或4 °C过夜。染色时应注意避光。(Liu等,2014)
  6. 吸干染料溶液,用PBS清洗3次,每次10 min。
  7. 按照1:10稀释20 ng/μl DAPI母液,并染色5 min。染色时应注意避光。
  8. 吸走DAPI,用PBS清洗3次,每次10 min。
  9. 80%甘油压片,用指甲油封片。封片后应尽快进行拍摄。如需保存样品,应避光并放于4 °C。
  10. 用激光共聚焦显微镜或者蔡司荧光显微镜扫描样品 (图1)。


    图1. 野生型果蝇三龄幼虫脂肪体脂滴染色. 蓝色荧光标示染料DAPI着色的细胞核;绿色荧光标示中性脂染料着色的脂滴;放大倍数:40倍。

溶液配方

  1. 1× PBS缓冲液
    137 mmol/L NaCl
    2.7 mmol/L KCl
    10 mmol/L Na2HPO4
    2 mmol/L KH2PO4
    用800 ml蒸馏水溶解8 g NaCl,0.2 g KCl, 1.44 g Na2PHO4和0.24 g KH2PO4。用HCl调节溶液的pH值至7.4,加水至1 L。分装后在15 psi (1.05 kg/cm2) 高压蒸汽灭菌20 min,或过滤除菌,室温保存
  2. 4% PFA
    10 g多聚甲醛溶解在0.1 M 磷酸钠缓冲液 (250 ml),60 °C加热搅拌至澄清,调pH到7.4。配制好的溶液于4 °C保存
  3. 4%甲醇溶液
    4 ml甲醇溶解于96 ml蒸馏水
  4. DAPI母液 (1 mg/ml)
    10 mg DAPI粉末加入10 ml双蒸水中配制成1 mg/ml母液,分装在10个EP管中,用锡箔纸包裹,置于-20 °C冰箱保存。实际使用时,将母液1:5,000稀释
  5. Nile Red (0.5 mg/ml)
    用丙酮配制0.5 mg/ml 的母液,配制好的溶液于4 °C保存。用时1:500~1:2,000稀释
  6. BODIPY (1 mg/ml)
    用DMSO或者无水乙醇配制1 mg/ml母液,用时1:500~1:1,000稀释。配制好的溶液于4 °C保存

参考文献

  1. Liu, Y., Wang, W., Shui, G. and Huang, X. (2014). CDP-diacylglycerol synthetase coordinates cell growth and fat storage through phosphatidylinositol metabolism and the insulin pathway. PLoS Genet 10(3): e1004172.
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:赵雪璠, 黄勋. (2019). 果蝇幼虫脂滴的标记观察. Bio-101: e1010272. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010272.
How to cite: Zhao, X. F. and Huang, X. (2019). Drosophila Larva Lipid Droplet Staining. Bio-101: e1010272. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010272.
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