果蝇凋亡检测—Caspase-3抗体染色法及TUNEL法   

张松灵张松灵#路春霖路春霖#秘晓林秘晓林  (*contributed equally to this work)
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摘要:细胞凋亡 (apoptosis) 是细胞在基因控制下有序死亡的方式。本文介绍了两种检测果蝇细胞凋亡的方法。第一种方法使用抗Caspase-3抗体,采用免疫荧光染色方法检测果蝇三期幼虫翅膀成虫盘中的凋亡。第二种方法是使用TUNEL法 (脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法) 鉴定DNA的断链。TUNEL法可以半定量DNA损伤,与免疫荧光染色方法相比,TUNEL染色阳性的凋亡细胞更容易检测和鉴定。 本章将依次对上述方法进行介绍。

关键词: 凋亡, Caspase-3, TUNEL, 果蝇


方法1: 抗Caspase-3抗体染色检测果蝇幼虫翅膀成虫盘中的凋亡细胞


摘要Caspase-3是Caspase家族的一员,作为效应Caspase在细胞凋亡中发挥作用。果蝇DrICE是Caspase-3的同源基因,序列和功能高度保守。由于该保守特性,虽然抗Caspase-3抗体并非来自果蝇,诸多研究证实它可以用于检测果蝇中的凋亡现象,并已成为检测果蝇凋亡的经典手段之一 (Liu等,2012;Fogarty和Bergmann,2014)。目前已有商业化的抗Caspase-3抗体,为检测提供了方便。
关键词:凋亡,果蝇翅膀成虫盘,抗Caspase-3抗体

材料与试剂

  1. 标准级显微镜载载玻片(25 × 75mm,厚度1 mm ± 0.2 mm)
  2. 盖玻片(22 × 22 mm)
  3. 1.5 ml离心管
  4. 移液枪头
  5. 果蝇三期幼虫
  6. 1× PBS
  7. Cleaved Caspase-3 (D175) Rabbit Antibody (Cell Signaling, catalog number: 9661L) (4 °C保存)
  8. Alexa Fluor(anti-rabbit) 488 (Cell Signaling, catalog number: 4412S) (4 °C保存)
  9. Alexa Fluor(anti-rabbit) 555 (Cell Signaling, catalog number: 4413S) (4 °C保存)
  10. 抗荧光淬灭剂 (Beyotime, catalog number: P0128-2) (-20 °C保存)
  11. 指甲油
  12. 甲醛 (Sigma, catalog number: F8775)
  13. Tween-20
  14. BSA
  15. 羊血清或马血清
  16. 0.3% PBST (见溶液配方)
  17. 固定液 (3.7%多聚甲醛) (见溶液配方)
  18. 封闭液 (见溶液配方)
    注:抗体用封闭液进行稀释。

仪器设备

  1. 移液枪
  2. 解剖镊
  3. 解剖皿
  4. 解剖镜 (奥林帕斯,model: SZ51-SET)
  5. 转移脱色摇床 (奥豪斯,model: TS-8)
  6. 正置荧光显微镜 (蔡司,model: Imager Z2)

实验步骤

  1. 收集活跃的果蝇三期幼虫,使用辐照或羟基脲 (Hydroxyurea, HU) 处理实验组果蝇,诱导产生DNA损伤。将实验组果蝇和对照组果蝇幼虫放置于捣碎的食物中,25 °C培养4 h。
  2. 挑取实验组和对照组果蝇幼虫各15只,用冷的PBS清洗虫体,放置到冷PBS中待解剖。对果蝇进行初步解剖:将虫体从中后部截断,用镊子抵住幼虫头部,用另一把镊子将虫体翻转套在抵住幼虫的镊子上,清除脂肪、肠道等组织,将成虫盘连同皮层放置于冰浴的含1 ml PBS的1.5 ml离心管中。
    注:解剖后的组织可以在室温下放置20分钟,或在冰上放置不超过1小时。
  3. 吸去上清,加入800 μl 3.7%甲醛,放置于摇床上,室温慢速固定20 rpm × 25 min。
  4. 吸去上清,加入800 μl PBS,放置于摇床上,室温慢速清洗20 rpm × 5 min,清洗3遍。
  5. 加入800 μl封闭液,室温封闭1 h。
  6. 吸去上清,加入100 μl 1:200稀释的抗Caspase-3抗体,4 °C孵育过夜。
  7. 回收抗体。加入800 μl封闭液,放置于摇床上,室温慢速清洗20 rpm × 15 min。
  8. 吸去上清,加入200 μl 1:400稀释的Alexa Fluor(anti-rabbit) 488 (绿色荧光) 或者555 (红色荧光) 标记的二抗,放置于摇床上,室温避光孵育20 rpm × 2 h。
  9. 吸去二抗,加入800 μl 0.3% PBST,放置于摇床上,室温避光慢速清洗20 rpm × 15 min,清洗3次。
  10. 在平皿中加一滴1× PBS,进行第二次解剖,将翅膀成虫盘完整的解剖下来置于PBS液滴中。
  11. 加一滴抗荧光淬灭剂于载玻片上,用镊子轻托翅膀成虫盘于载玻片,盖上盖玻片封片,四周涂上指甲油,4 °C保存样品。
    注:尽快进行拍照,样品保存不超过3天。
  12. 使用正置荧光显微镜或共聚焦显微镜拍照。
    正置荧光显微镜 (蔡司,Imager Z2) 工作条件:激发波长520~560 nm,绿光;检测波长570~620 nm,红光。结果如图1所示。

结果与分析



图1. 抗Caspase-3抗体染色检测果蝇三期幼虫翅膀成虫盘的凋亡细胞. 使用正置荧光显微镜拍摄。40 Gy辐照处理后,果蝇翅膀成虫盘的翅囊区出现抗Caspase-3抗体染色,即存在凋亡细胞,铰链区无凋亡信号。比例尺:100 μm。

方法2: TUNEL法检测果蝇幼虫翅膀成虫盘中的凋亡细胞

摘要:凋亡细胞中染色体DNA断裂的形成是一个渐进过程。在脱氧核糖核苷酸末端转移酶 (TdT) 的作用下,可以对DNA断裂缺口的3ʹ-OH进行标记,借助荧光素等标记物,对凋亡细胞进行检测。TUNEL法 (TdT-mediated dUTP end nick labeling),也称DNA缺口的末端标记法,将凋亡细胞的形态特征与生物化学特征结合在一起,可以检测到非常少量的凋亡细胞,灵敏度高,被广泛应用于凋亡细胞的检测 (Yung等,2009;Wang等,2013;Verghese和Su,2016)。
关键词:凋亡,果蝇翅膀成虫盘,TUNEL

材料与试剂

  1. 标准级显微镜载玻片 (25 × 75 mm,厚度1 mm ± 0.2 mm)
  2. 盖玻片 (22 × 22 mm)
  3. 1.5 ml离心管
  4. 平皿
  5. 移液枪头
  6. 果蝇三期幼虫
  7. 1× PBS (4 °C保存)
  8. Triton X-100 (Sigma, catalog number: T8787) (常温保存)
  9. 抗荧光淬灭剂 (Beyotime, catalog number: P0128) (-20 °C保存)
  10. TUNEL试剂盒 (TMR-red;Roche, catalog number: 12156792910) (-20 °C保存)
  11. 指甲油
  12. 甲醛 (Sigma, catalog number: F8775)
  13. Triton X-100 (Sigma, catalog number: T8787)
  14. 柠檬酸钠 (上海沪试)
  15. 固定液 (3.7%多聚甲醛) (见溶液配方) (新鲜配制)
  16. PBTx (见溶液配方) (4 °C保存)
  17. PBTx5 (见溶液配方) (4 °C保存)
  18. 柠檬酸钠溶液 (见溶液配方) (新鲜配制)

仪器设备

  1. 移液枪
  2. 解剖镊
  3. 解剖皿
  4. 解剖显微镜 (奥林帕斯,model: SZ51)
  5. 转移脱色摇床 (奥豪斯,model: TS-8)
  6. 加盖水浴锅 (37 °C)
  7. 台式离心机 (赛多利斯,1-14)
  8. 金属浴 (65 °C)
  9. 共聚焦显微镜 (徕卡,model: TCS SP5) 或正置荧光显微镜 (蔡司,mode: Imager Z2)

实验步骤

  1. 挑取DNA损伤处理后的实验组和对照组果蝇三期幼虫各15只,用冷PBS清洗虫体,放置到冷PBS中。对果蝇进行初步解剖:将虫体从中后部截断,用镊子抵住幼虫头部,用另一把镊子将虫体翻转套在抵住幼虫的镊子上,清除脂肪、肠道等组织,将成虫盘连同皮层放置于冰浴的含1 ml PBS的1.5 ml离心管中。
    注:解剖后的组织可以在室温下放置20分钟,或在冰上最多放置1小时。
  2. 加入800 μl固定液,放置于转移脱色摇床,室温慢速固定20 rpm × 20 min。
  3. 室温离心,1,000 × g 1 min,废弃液体。
  4. 加入800 μl PBTx,放置于转移脱色摇床,室温慢速清洗20 rpm × 10 min,清洗3次。
  5. 室温离心,1,000 × g 1 min,废弃液体。
  6. 加入800 μl PBTx5,放置于转移脱色摇床,室温慢速清洗20 rpm × 5 min,废弃液体。
  7. 加入800 μl柠檬酸钠溶液,于65 °C金属浴孵育30 min。
  8. 室温离心,1,000 × g 1 min,废弃液体。
  9. 加入800 μl PBTx,放置于转移脱色摇床,室温慢速清洗20 rpm × 10 min,清洗3次。
  10. 尽可能吸净上一步骤残余液体,使样本周围的区域干燥。
  11. 加入100 μl TUNEL反应混合物 (10 μl反应液 + 90 μl标记液),轻弹混匀。反应混合物可在第9步提前配制,配制时于冰上操作,注意避光。
  12. 在避光、湿润的环境中 (加盖水浴锅),37 °C孵育3 h或者过夜。
  13. 室温离心,1,000 × g 1 min,废弃液体。
  14. 加入800 μl PBTx,放置于转移脱色摇床,室温慢速清洗20 rpm × 10 min,清洗3次。
  15. 在干净平皿中加一滴PBS,进一步解剖,将翅膀成虫盘与肌肉组织分离,待所有样品解剖完成后将其转移至滴加抗荧光淬灭剂的载玻片上。
  16. 将盖玻片从一侧轻盖在样品上,避免组织变形,四周涂上指甲油,4 °C保存样品。
  17. 使用共聚焦显微镜或正置荧光显微镜拍照。
    正置荧光显微镜 (蔡司,Imager Z2) 工作条件:激发波长520~560 nm,绿光;检测波长570 ~ 620 nm,红光。结果如图2所示。
    共聚焦显微镜 (徕卡,TCS SP5) 工作条件:激发波长520~560 nm,绿光;检测波长570 ~ 620 nm,红光。结果如图3所示。
    注:尽快进行拍照,样品保存不超过3天。

结果与分析



图2. TUNEL法检测果蝇凋亡细胞. 正置荧光显微镜拍摄。HU药物处理6 h后,果蝇翅膀成虫盘出现大量凋亡细胞。比例尺:100 μm。

图3. TUNEL法检测果蝇凋亡细胞. 共聚焦荧光显微镜拍摄。HU药物处理6 h后,果蝇翅膀成虫盘出现大量凋亡细胞。比例尺:50 μm。

注意事项

  1. 解剖是本实验的第一个步骤,也是非常重要的一个步骤。当组织失去正常的营养交换开始死亡。在组织制备过程中,快速解剖和使用冰浴缓冲液可以减少解剖过程中产生的损伤。初步解剖需要将脂肪等能够吸收抗体的组织去除干净,以免影响孵育的效率。此外,需要用解剖镊轻轻将成虫盘暴露在外面,降低无关组织的掩盖或者遮挡。
  2. 抗体孵育是免疫荧光染色的核心步骤。抗体的稀释倍数是其中很重要的一点,好的实验结果由强的阳性信号和低的染色背景组成。需要选择合适的一抗稀释倍数,实现较好的信噪比。不同来源的抗体可能有不同的最佳稀释倍数,需要通过预实验来确定。二抗稀释倍数可以根据说明书或者预实验来确定。二抗的孵育及之后的步骤都需要避光。
  3. 样品的洗涤贯穿了整个实验,尽可能吸净上一步液体以减少对下一步实验的影响,并且注意样品没有丢失。
  4. 压片是实验操作最后一个步骤,也是决定实验成败的最后一块砖石。要保证组织样品的完整性。在载玻片上滴加的抗荧光淬灭剂不能过多,防止组织滑动损伤。
  5. 实验完成要尽快拍照,时间过长有可能导致荧光的淬灭,使照片质量下降。
  6. 在TUNEL染色过程中可能出现标记不成功的现象,可以在步骤7中使用替代渗透法,将样品置于10 μg/ml蛋白酶K的PBTx溶液中,室温孵育3~5 min。
  7. 如果TUNEL反应标记不明显,可以将成虫盘及其连接的肌肉组织共同解剖下来后,用解剖镊轻轻将成虫盘暴露在外;或者PBTx5孵育延长至10 min。
  8. TUNEL检测用的柠檬酸钠溶液现配现用渗透效果最好;此外过夜孵育TUNEL反应液,可以使反应更加充分。

溶液配方

  1. 0.3% PBST (4 °C保存)
    1× PBS
    0.3% Tween-20
  2. 封闭液 (新鲜配制)
    0.3% PBST + 1% BSA + 2%羊血清;或0.3% PBST + 5%马血清 
  3. 固定液 (3.7%多聚甲醛,1× PBS新鲜配制)
    9.63 ml 1× PBS
    加370 μl甲醛 (Sigma)
  4. PBTx
    100 ml 1× PBS
    加100 μl Triton X-100 (Sigma)
    4 °C保存
  5. PBTx5
    100 ml 1× PBS
    加500 μl Triton X-100 (Sigma)
    4 °C保存
  6. 柠檬酸钠溶液
    50 ml PBTx
    加1.47 g柠檬酸钠 (上海沪试)
    4 °C保存

致谢

感谢实验室所有过去和现在成员的工作,完善了本文方法。这项工作得到了国家重大基础研究项目-“973”项目 (2010CB934004),国家自然科学基金项目(31771437,31501165,31271480,30871388),中国科学院“百人计划”,辽宁省“攀登学者”的支持。
以上实验方法已在下列论文中使用:Liu等 (2012);Wang等 (2013)。
作者贡献声明:本文中方法1由路春霖撰写,张松灵,路春霖修改;方法2由张松灵撰写,路春霖,张松灵修改。秘晓林审校。

参考文献

  1. Fogarty, C. E. and Bergmann, A. (2014). Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol 1133: 109-117.
  2. Liu, W., Jiang, F., Bi, X. and Zhang, Y. Q. (2012). Drosophila FMRP participates in the DNA damage response by regulating G2/M cell cycle checkpoint and apoptosis. Hum Mol Genet 21(21): 4655-4668.
  3. Verghese, S. and Su, T. T. (2016). Drosophila Wnt and STAT define apoptosis-resistant epithelial cells for tissue regeneration after irradiation. PLoS Biol 14(9): e1002536.
  4. Wang, Y., Wang, Z., Joshi, B. H., Puri, R. K., Stultz, B., Yuan, Q., Bai, Y., Zhou, P., Yuan, Z., Hursh, D. A. and Bi, X. (2013). The tumor suppressor Caliban regulates DNA damage-induced apoptosis through p53-dependent and -independent activity. Oncogene 32(33): 3857-3866.
  5. Yung, Y. C., Kennedy, G. and Chun, J. (2009). Identification of neural programmed cell death through the detection of DNA fragmentation in situ and by PCR. Curr Protoc Neurosci Chapter 3: Unit 3.8.
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:张松灵, 路春霖, 秘晓林. (2019). 果蝇凋亡检测—Caspase-3抗体染色法及TUNEL法. Bio-101: e1010268. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010268.
How to cite: Zhang, S. L., Lu, C. L. and Bi, X. L. (2019). Detection of Apoptotic Cells in Drosophila by Anti-Caspase-3 Antibody-based Staining and TUNEL Assay. Bio-101: e1010268. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010268.
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