果蝇Schneider 2细胞培养   

龙婷龙婷*刘敏刘敏*朱健朱健  (*contributed equally to this work)
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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

 

摘要:果蝇Schneider 2 (S2) 细胞培养简单,是生化和免疫组化等实验中最常用的果蝇细胞系。该细胞系于1972年由Imogene Schneider从果蝇胚胎中分离得到 (Schneider, 1972),是一种血淋巴来源的细胞。本方案主要介绍果蝇S2细胞的培养、复苏和冻存操作。

关键词: 果蝇, S2细胞培养, 细胞复苏

材料与试剂

  1. 细胞冻存管 (Corning, catalog number: 430659)
  2. 10 ml塑料移液管 (Corning, Costar, catalog number: 4488)
  3. 15 ml塑料离心管 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 339650)
  4. 50 ml塑料离心管 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 339652)
  5. 6孔细胞培养板 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 140675)
  6. 24孔细胞培养板 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 142475)
  7. 细胞培养瓶 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 156367)
  8. 细胞培养皿 (Thermo Fisher Scientific, Nunc, catalog number: 150464)
  9. 一次性无菌过滤装置 (Thermo Fisher Scientific, Nalgene, catalog number: 1660045)
  10. 程序降温盒 (Thermo Fisher Scientific, Nalgene, 5100-0001)
  11. 1 ml带滤芯的移液枪头 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: TF112-1000-Q)
  12. 75%酒精消毒液 (ANNJET, 75%酒精消毒液)
  13. 胎牛血清 (Cellmax, SA301.02)
  14. Schneider果蝇培养基 (Thermo Fisher Scientific, Gibco, catalog number: 21720-024)
  15. 青链霉素混合液 (Thermo Fisher Scientific, Gibco, catalog number: 15140122)

仪器设备

  1. 二级生物安全柜 (Esco, Airstream A2)
  2. 细胞培养箱 (SANYO, MCO-18AIC):有恒温和保湿功能即可,温度设定为25 °C,湿度设定为70%,果蝇S2细胞培养不需要通入CO2气体
  3. 真空泵 (Millipore, WP6122050)
  4. 倒置荧光显微镜 (Leica, DM IL LED)
  5. 移液枪 (Drummond, Pipet-Aid XP)
  6. 移液器 (Gilson, model: P1000)
  7. 恒温水浴锅 (Thermo Fisher Scientific, ISOTEMP 202)
  8. -80 °C超低温冰箱 (Esco, Lexicon, UUS-668B-1)
  9. 4 °C及-20 °C冰箱 (Haier, BCD-539WT)

实验步骤

  1. 细胞传代及下游实验准备
    S2细胞是一种半悬浮细胞,在细胞传代时不需要使用胰酶消化。
    1.1
    倒置显微镜下观察培养细胞,若密度达到1 × 107/ml则需要进行传代 (图1)。在25 °C培养条件下,一般3天左右进行一次传代。若细胞密度低于0.5 × 105/ml,请勿进行传代,否则细胞增殖会很缓慢。


    图1. 传代前及传代后细胞形态与密度图. 细胞密度达到左图所示程度时,需要进行传代。右图为传代操作1小时后,细胞完成贴壁时的形态与密度图。比例尺为50 μm。

    1.2
    将培养基在室温放置,至其温度达到20~25 °C。
    1.3
    准备一个新的细胞培养瓶,加入4.5 ml新鲜的培养基。如果需要进行下游实验,还需要准备好6孔细胞培养板或者24孔细胞培养板。6孔细胞培养板每孔加入1.8 ml培养基,24孔细胞培养板每孔加入450 μl培养基。
    1.4
    使用移液枪从细胞培养瓶底部轻柔地吹起细胞并混匀。
    1.5
    以1:10的比例接种细胞至细胞培养瓶或者细胞培养板中,比如细胞培养瓶中加入500 μl。接种细胞浓度为0.5~1 × 106/ml,接种浓度过低,会导致细胞生长缓慢。部分稳转细胞系需要增加接种量。
    1.6
    轻柔地晃匀细胞,注明细胞传代次数和接种时间,放入25 °C细胞培养箱即可。在该培养条件下,一般12~24小时后可进行细胞转染。
  2. 细胞复苏
    S2细胞不是可以无限传代的细胞,一般培养到20~25代的时候需要复苏新的细胞。此时的细胞形态差,贴壁比例降低,生长慢,转染效率低。
    2.1
    预热25 °C恒温水浴锅。准备干净的细胞培养瓶一个,加入室温的培养基4 ml。
    2.2
    从液氮中取出一管冻存的S2细胞,在25 °C恒温水浴锅中用手轻柔摇晃。在细胞化冻之后,立即用75%酒精消毒液消毒整个冻存管,然后拿进生物安全柜中。
    2.3
    将化冻的细胞缓慢加入准备好的细胞培养瓶中,轻轻晃动细胞培养瓶,使细胞均匀分布在细胞培养瓶中。
    2.4
    将细胞培养瓶放入25 °C细胞培养箱,等待细胞贴壁。该过程需要6小时左右。
    2.5
    倒置显微镜下观察到大部分细胞贴壁后,更换5 ml室温的培养基。之后每3天按此法更换一次新鲜的培养基,直到细胞开始增殖。一般情况下,从接种到增殖需要4到6天。
    2.6
    细胞增殖到1 × 107/ml的时候即可按1中的方法进行细胞传代及下游实验准备工作。
  3. 细胞冻存
    传代次数少的细胞可以进行细胞冻存,以备下次复苏。
    3.1
    准备干净的直径为100 mm的细胞培养皿一个,加入9 ml室温的培养基,向其中接种1 ml细胞,接种浓度为0.5~1 × 106/ml。放入细胞培养箱中让细胞增殖。
    3.2
    倒置显微镜下观察细胞密度,当细胞生长到约5 × 106/ml的时候可以开始准备冻存。
    3.3
    准备15 ml塑料离心管一个,2 ml细胞冻存管3个。
    3.4
    用移液器从细胞培养皿中吸出上清至皿中剩余1.5 ml旧培养基。向细胞培养皿中加入1.5 ml室温的培养基,用移液枪将细胞轻轻吹吸悬起。然后转移到准备好的15 ml塑料离心管中。加入333 μl DMSO,轻柔地上下颠倒混匀。
    3.5
    将待冻存的细胞按1 ml/管分装到准备好的冻存管中,写明传代次数和冻存时间,放入程序降温盒置于-80 °C超低温冰箱中,等待12小时。
    3.6
    将细胞转移到液氮中保存。

注意事项

  1. 细胞增殖缓慢—如果是接种量较低引起的,可以加大接种量;如果没有可接种的细胞,可以3天更换一次新鲜的培养基,等待细胞增殖到合适的密度再进行传代;如果有其他增殖良好的细胞,可以将增殖良好的细胞孔中的培养基吸出,以0.22 μm滤器过滤,将过滤过的培养基加入到该增殖缓慢的细胞孔中。
  2. 细胞传代次数过多—复苏细胞。
  3. 细胞接种量太小—加大接种量。
  4. 细胞营养不良:细胞传代次数不多,形态正常,但是增殖缓慢且转染效率低—适当增加培养基中胎牛血清的含量。

溶液配方

  1. 细胞培养基
    89% Schneider果蝇培养基
    10%胎牛血清
    1%青链霉素

    培养基的配制方法:
    1)
    室温化冻胎牛血清。建议将化冻后的胎牛血清按50 ml/管分装到50 ml塑料离心管中,保存在-80 °C,以便之后的化冻
    2)
    室温化冻青链霉素混合液。建议将青链霉素混合液按10 ml/管分装到15 ml塑料离心管中,保存在-20 °C,以便之后使用
    3)
    准备一次性无菌过滤装置一个,连接真空泵。向该装置中加入5 ml青链霉素混合液和50 ml胎牛血清。加入Schneider果蝇培养基使液体总体积为500 ml
    4)
    打开真空泵,待液体过滤完之后关闭真空泵。过滤好的培养基放入4 °C冰箱保存
    5)
    在使用培养基进行实验之前需要将其预热到室温

致谢

本实验室的工作得到细胞增殖与分化重点教育部重点实验室、膜生物学国家重点实验室、生命科学联合中心、国家自然科学基金和科学技术部的资金支持。

参考文献

  1. Schneider, I. (1972). Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol 27(2): 353-365.
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:龙婷, 刘敏, 朱健. (2019). 果蝇Schneider 2细胞培养. Bio-101: e1010259. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010259.
How to cite: Long, T., Liu, M. and Zhu, A. J. (2019). Culturing Drosophila Schneider 2 Cells. Bio-101: e1010259. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010259.
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