果蝇基因组DNA制备   

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摘要:主要介绍快速简单制备果蝇的基因组DNA的方法,可以为后续的实验比如基因扩增提供高质量的模板。

关键词: 果蝇基因组, DNA制备

材料与试剂

  1. 1.5 ml离心管
  2. 动物基因组DNA抽提试剂盒 (生工生物工程(上海)有限公司, catalog number: B518221)
  3. 氯仿
  4. 异丙醇
  5. 乙醇
  6. Tris
  7. HCl
  8. EDTA
  9. RNase A (10 mg/ml)
  10. TE buffer (见溶液配方)

仪器设备

  1. 移液器
  2. 水浴锅 (上海精宏实验设备有限公司, model: XMTE-8112)
  3. 小型高速离心机 (Eppendorf)
  4. 一次性组织研磨杵(生工生物工程(上海)有限公司, catalog number: F619071)

实验步骤

注:提前将水浴锅调至65 °C备用。Buffer Digestion在低温下可能产生沉淀,使用前请检查,如有沉淀,请于65 °C溶解后使用。

  1. 取20~25只果蝇,加入到1.5 ml离心管中,加入400 μl Buffer Digestion,用研磨棒研碎,震荡混匀。65 °C水浴1 h至完全裂解。
    1.1
    通常动物组织完全裂解需要1~3小时,取样过多会影响提取DNA的质量。
    1.2
    水浴过程中,每10 min颠倒混匀一次,可促进样品裂解。混合液变澄清透明为裂解完全。如溶液未变澄清,说明细胞裂解不彻底,应适当延长水浴时间,否则将可能降低DNA的得率或导致提取的DNA不纯。
    1.3
    如需得到无RNA的DNA,可在水浴后加入20 μl的RNase A (10 mg/ml),室温放置2~5 min。
  2. 加入200 μl Buffer PA,充分颠倒混匀,置于-20 °C冰箱放置5 min。
  3. 室温10,000 rpm离心5 min,将上清液 (500~550 μl) 转移到新的1.5 ml离心管中。
    注:若上清液混浊,可再加入等体积氯仿剧烈混匀,12,000 rpm离心取上清。
  4. 加入等体积的异丙醇,颠倒5~8次使之充分混匀,室温放置2~3 min。室温10,000 rpm离心5 min,弃上清。
  5. 加入1 ml 75%乙醇,颠倒漂洗1~3 min,10,000 rpm离心2 min,弃上清。
    注:漂洗时一定要使沉淀悬浮起来。
  6. 重复一次步骤5,如果倒掉液体后残留的乙醇有挂壁现象,则再短暂离心,将残液用移液器吸出。
  7. 开盖室温倒置5~10 min至残留的乙醇完全挥发。
    注:
    1)
    此步绝不可省略,否则残留的乙醇会严重影响后续实验。
    2)
    过度干燥将导致DNA重新溶解困难,肉眼可见DNA沉淀变成半透明状,离心管无明显乙醇味道即可,避免使用真空干燥器进行干燥。
  8. 得到的DNA用100~200 μl TE Buffer (10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,pH 8.0) 溶解。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20 °C保存。
    注:25只果蝇成虫个体能得到约200 μg的DNA。

溶液配方

  1. TE buffer (pH 8.0)
    10 mM Tris-HCl
    1 mM EDTA
Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:邓娟 , 刘南. (2019). 果蝇基因组DNA制备. Bio-101: e1010253. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010253.
How to cite: Deng, J and Liu, N. (2019). Drosophila Genomic DNA Preparation. Bio-101: e1010253. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010253.
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