实验原理:在一定的温度和离子浓度下,使具有地高辛标记的特异序列RNA探针通过碱基互补规则与果蝇幼虫中枢神经组织中待测的RNA结合,之后通过探针上所标记的检测系统将待测RNA在果蝇幼虫中枢神经组织中的位置进行定位。 实验目的:检测某种特定RNA在果蝇幼虫中枢神经组织细胞中的表达分布情况。
关键词: RNA探针, 地高辛, 神经系统, 幼虫, 果蝇
材料与试剂
一、 实验器具
仪器设备
注:所有玻璃器皿和金属用具进行无RNA酶处理。具体操作:洗净烘干后用锡箔纸封口,180 °C烘烤4小时。所有不能烘烤的器皿用大量RNase free水冲洗,然后用擦镜纸沾取RNase AWAY (Invitrogen) 擦拭。实验台面用纸巾沾取无水乙醇擦拭。
实验步骤
实验步骤参考Inagaki等,(2005);Li等,(2012和2014);Tautz和Pfeifle,(1989)。
第一天 一、 解剖和固定 (保持无RNA酶污染) 以做5管幼虫CNS原位杂交为例,第一天需要的溶液量:
二、 杂交 (保持无RNA酶污染) 以做5管幼虫CNS原位杂交为例,第二天需要的溶液量:
三、 洗涤和抗体孵育 以做5管幼虫CNS原位杂交为例,第二天需要的溶液量:
注:步骤2~7中的杂交液应予以丢弃,不再回收使用。
四、 洗涤和染色
溶液配方
致谢
该文章得到国家自然科学基金 (31571033,91632107) 和中国科学院前沿重点研究计划 (QYZDY-SSW-SMC015) 的资助;该实验方案改编自中国科学院生物物理研究所温省云博士毕业论文 (2012);使用该实验方案发表的文章:Li等 (2012和2014)。
参考文献
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