苹果果实细胞超薄切片的制备及超微结构透射电镜观察   

材料与试剂

注: 除特别说明，所用试剂均为购自sigma-Aldrich公司。

1. 刀片 (普通双面刀片，用于切取果肉组织)
2. 包埋盒
3. Formvar
4. 苹果
5. 多聚甲醛
6.  戊二醛
7. PBS (磷酸缓冲液 pH 7.2)
8. 锇酸
9. 乙醇
10. 丙酮
11. Spur
12. 前固定液 (见溶液配方)
13. 1% (w/v) 锇酸 (蒸馏水配制)
    

仪器设备

1. 4 °C 冰箱
2. 70 °C 恒温箱
3. LKB-8800型切片机
4. 镍网
5. 透射电镜
   

实验步骤

注：除特别说明外，所有操作步骤均可在室温下进行。

1. 前固定：将苹果果肉组织切分成2-3 mm³的小块，放入到前固定液 (见溶液配方) 中，抽气并在4 °C下固定组织块4 h。
2. 冲洗：用4 °C保存的0.1 M PBS 洗三次，每次30 min。
3. 后固定：1%锇酸4 °C下固定1.5-2 h。
4. 冲洗：用0.1 M PBS (pH 7.2) 4 °C洗三次，每次30 min。
5. 脱水
   30%乙醇 (20min)→50%乙醇 (20min)→70%乙醇 (过夜)→80%乙醇 (20min)→90%乙醇 (60min)→100%乙醇 (60min)→100%乙醇 (60min)→100%乙醇 (20min)→丙酮 (20min)→丙酮 (20min) →丙酮 (20 min) 
6. 置换
   丙酮：Spur 2：1 1 h
   丙酮：Spur 1：1 1 h
   丙酮：Spur 1：2 1 h
   纯Spur 1 h
7. 浸透：纯Spur浸透24 h以上。
8. 包埋：Spur包埋。
   注：不含水分及气泡。
9. 70 °C下聚合8 h以上。
10. 切片：用LKB-8800型切片机制备超薄切片，切片捞在100目以0.3% Formvar膜覆盖的镍网上
11. 用透射电镜进行细胞超微结构观察。

溶液配方

注：本实验方案中所需的溶液除特殊说明外，均用蒸馏水配制。

1. 前固定液
   4% (v/v) 多聚甲醛
   2.5% (v/v) 戊二醛
   0.1 M PBS, pH 7.2 配制
2. 1% (w/v) 锇酸
   

致谢

感谢国家自然科学基金 (30700646) 资助。本篇实验方案改编自先前发表的文章 Zhang et al. (2004)。

参考文献

1. Zhang, L. Y., Peng, Y. B., Pelleschi-Travier, S., Fan, Y., Lu, Y. F., Lu, Y. M., Gao, X. P., Shen, Y. Y., Delrot, S. and Zhang, D. P. (2004). Evidence for apoplasmic phloem unloading in developing apple fruit. Plant Physiol 135(1): 574-586.