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Extraction and Determination of Cellulose and Pectin in Strawberry Cell Wall   

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实验目的:利用细胞壁不同组分的溶解性分步将水溶型果胶、离子型果胶、共价型果胶、易溶性半纤维素、难溶性半纤维素和纤维素提取,再用分光光度计法测量物质成分的浓度。

关键词: 草莓, 果胶, 半纤维素, 纤维素

材料与试剂

  1. 草莓
  2. 乙醇
  3. Tris酚 (华佰泰生物)
  4. 氯仿 (北京化工)
  5. 甲醇 (北京化工)
  6. 丙酮 (北京化工)
  7. KOH
  8. NaBH4
  9. Tris
  10. HCl
  11. CDTA
  12. α-淀粉酶
  13. 四硼酸钠
  14. 浓硫酸 (北京化工) 
  15. NaOH
  16. D-半乳糖醛酸 (标样)
  17. 葡萄糖 (标样)
  18. 50 mM 乙酸溶液 pH 6.5
  19. 4%KOH (0.1%NaBH4)
  20. 0.1 M Tris-HCl (pH 7.0)
  21. 0.15%间羟基联苯 (用0.5%的NaOH溶解)
  22. 50 mM CDTA-乙酸钠 (见溶液配方)
  23. 50 mM 碳酸钠 (2 mM CDTA) 溶液(见溶液配方)
  24. 0.48%四硼酸钠-硫酸 (见溶液配方)
  25. 蒽酮-硫酸 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 移液器
  2. 研磨器具
  3. 34 °C烘箱
  4. 离心机
  5. 4 °C冰箱
  6. 透析袋 (留存分子量3,500,购自Biotopped,美国)

实验步骤

  1. 细胞壁干物质的提取
    参照Brummell et al. (2004) 的方法。取果肉10 g,研磨后加入50 ml 80%的乙醇溶液混匀后过滤,收集沉淀,向沉淀中加入100 ml 80%的乙醇溶液,并混匀。过滤,沉淀加入40 ml Tris酚 (pH 7.0),混匀之后在室温下放置30 min。(再加入100 ml 80%乙醇,放入-20 °C反应1 h,过滤,再用100 ml 95%乙醇洗一遍-可省略) 过滤,沉淀加入100 ml 氯仿:甲醇 (1:1) 溶液反应30 min室温,混匀之后过滤,沉淀加入100 ml 丙酮溶液洗涤,过滤得到沉淀,将沉淀放在34 °C烘箱中12 h,得到细胞壁干物质。称并记录干物质质量。
    注:该过程需要大量有机试剂,气味重,且有一定毒性,建议戴口罩,在通风橱进行试验。
  2. 果胶和纤维素的提取
    1)
    参考Rose et al. (1998) 的方法。取干物质100 mg,加入20 ml 50 mM的乙酸溶液 (pH 6.5),室温下反应24 h,离心得到上清液,取1 ml定容至10 ml即为水溶性果胶。
    2)
    在剩余沉淀加入20 ml 的 50 mM CDTA-乙酸钠 (pH 6.5) (见溶液配方1),室温下反应24 h,离心10,000 x g 15 min,上清液定容至25 ml,取1 ml进行透析24 h,将透析液定容至5 ml,得到即为离子型果胶。
    注:透析前,检测透析袋是否漏水;透析袋呈管状,透析前先用夹子封好一侧,在加完透析液后将另一侧封好,用挂牌做好标记,放进纯水中透析,最好用磁力搅拌器加速透析,最好每隔2 h换一次水,使透析充分。
    3)
    在剩余沉淀加入20 ml 的 50 mM 的碳酸钠 (2 mM CDTA) 溶液 (见溶液配方2),4 °C反应24 h (4 °C 18 h,室温2 h),离心,(上清液在冰上用乙酸进行中和,之后定容至50 ml,取1 ml透析24 h) 透析得到共价性果胶。
    4)
    在剩余沉淀加入20 ml 4%KOH (0.1% NaBH4),室温下反应48 h,离心上清液加入2倍体积的无水乙醇在4 °C中过夜沉淀,之后离心弃掉上清液,沉淀加入10 ml 0.1 M Tris-HCl (pH 7.0) 含30个单位的α-淀粉酶,室温下反应24 h,取1 mL透析得到的溶液即为易溶性半纤维素。
    注:α-淀粉酶要现用现配。
    5)
    在剩余沉淀加入20 ml 24%KOH,室温下反应48 h,离心上清液加入2倍体积的无水乙醇在4 °C中过夜沉淀,之后离心弃掉上清液,沉淀加入10 ml 0.1 M Tris-HCl (pH 7.0) 含30个单位的α-淀粉酶,室温下反应24 h,取1 ml透析得到的溶液即为难溶性半纤维素。
    注:α-淀粉酶要现用现配。
    6)
    最后剩余沉淀用去离子水洗2遍,65 °C烘箱烘干即为纤维素。
    注:沉淀要充分洗净,否则干燥后易出现盐结晶。
  3. 果胶和纤维素的测定
    1)
    参照Blumenkrantz and Asboe-Hansen (1973) 的方法,取1 ml 的提取液加入6 ml 的0.48%四硼酸钠-硫酸溶液 (见溶液配方3) 混匀,煮沸10 min ,冷却至室温后加入100 μl 0.15%间羟基联苯 (用0.5%的NaOH溶解) 溶液,对照样品加入100 μl 0.5%NaOH溶液,立即混匀,室温放置40 min,在波长520 nm处测定吸光度。用1 ml的去离子水用上述方法操作得到空白对照调零。以D-半乳糖醛酸做标准曲线,结果以mg/g表示。
    注:在样品中加入四硼酸钠-硫酸溶液后,盖紧试管塞,上下摇晃混匀;操作浓硫酸时注意安全。
    2)
    用蒽酮硫酸法测定半纤维素含量。取2 ml提取液加入5 ml蒽酮-硫酸 (见溶液配方4),混匀后在沸水中煮沸10 min,冷却至室温后在波长620 nm处测定吸光度,用2 ml去离子水用上述方法操作得到空白对照调零。以葡萄糖做标准曲线,结果以mg/g表示。
    注:在样品中加入蒽酮-硫酸后,盖紧试管塞,上下摇晃混匀;操作浓硫酸时注意安全。

结果与分析

  1. 在520.0 nm下,不同处理后草莓果实吸光值由标准曲线转化后的数据 (表1)

    表1. 不同处理草莓果实水溶型果胶含量

溶液配方

  1. 50 mM CDTA-乙酸钠
    50 mM CDTA,用乙酸钠溶解并定容
  2. 50 mM 碳酸钠 (2 mM CDTA) 溶液
    50 mM 碳酸钠,加入母液CDTA至终浓度为2 mM
  3. 0.48%四硼酸钠-硫酸
    2.4 g
    四硼酸钠
    500 ml
    硫酸
  4. 蒽酮-硫酸 
    0.25 g
    蒽酮
    100 ml
    浓硫酸

致谢

感谢国家自然基金 (31370323) 的支持。

参考文献

  1. Blumenkrantz, N. and Asboe-Hansen, G. (1973). New method for quantitative determination of uronic acids. Anal Biochem 54(2): 484-489.
  2. Brummell, D. A., Dal Cin, V., Crisosto, C. H. and Labavitch, J. M. (2004). Cell wall metabolism during maturation, ripening and senescence of peach fruit. J Exp Bot 55(405): 2029-2039.
  3. Rose, J. K., Hadfield, K. A., Labavitch, J. M. and Bennett, A. B. (1998). Temporal sequence of cell wall disassembly in rapidly ripening melon fruit. Plant Physiol 117(2): 345-361.
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Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:张伟伟 , 邢宇 . (2018). 草莓细胞壁物质测定. Bio-101: e1010217. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010217.
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宇航 田
请问如果把透析袋换成4000D的影响大吗
9/9/2021 4:49:02 PM Reply
伟 李
CDTA不溶于水,将CDTA用乙酸钠溶解是怎么做到的,做实验时遇到了,急等方法
6/23/2021 8:11:50 PM Reply
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