不同种质柑橘果实各组织中类黄酮LC-MS检测   

材料与试剂

1. 色谱柱 (shim-packVP-ODS C18 (pore size 5.0 μm, length 2 x 150 mm))
   
2. 内标 (Lidocaine)
   
3. 类黄酮标准品 (apigenin 6-C-glucoside, apigenin 7-O-glucoside, luteolin 7-O-glucoside等)
   
4. 乙酸
   
5. 甲醇 (色谱纯)
   
6. 乙腈 (色谱纯)
   
7. 超纯水
   

仪器设备

1. Milli-Q s ULTRA purification system (Millipore, Milford, MA, USA)
   
2. HPLC-ESI-QqTOF-MS/MS (用于定性分析，靶向MS²模式)
   
3. LC-ESI-Q TRAP-MS/MS (用于定量分析，MRM模式)

实验步骤

1. 组织提取物通过HPLC-ESI-QqTOF-MS/MS进行检测，且利用靶向MS²模式进行代谢物的定性分析。HPLC体系如下所述：色谱柱，shim-pack VP-ODS C18 (粒径5.0 μm，长度2 × 150 mm)；流动相，水 (含有0.04%乙酸)，乙腈 (含有0.04%乙酸)；梯度洗脱条件，0 min时，95:5 V/V，20 min时，5:95 V/V，22 min，5:95 V/V，22.1 min，95:5 V/V，25 min时，95:5 V/V；流速，0.25 ml/min；柱温，40 °C；进样体积，2 μl。利用安捷伦6520精确飞行时间质谱 (Q-TOF) 法进行HPLC流出物的全时扫描，其中m/z范围为50-1,000，检测模式为正离子模式 (http://www.chem.agilent.com/en-US/products-services/Instruments-Systems/Mass-Spectrometry/Pages/default.aspx)。参数设置如下所示：雾化气体，氮气，40 psi；干燥气体，氮气，10 L/min，350 °C；毛细管电压，3500 V；碎裂电压，135 V；微光电压，65 V；八极杆射频电压峰值，750 V。在MS模式下，扫描质量范围为m/z 50-1,000，且采集速率和收集时间分别为2 spectra/s和500 ms/spectrum。对于MS²模式，碰撞电压设置为10，20和30 V，且隔离宽度为± 4 m/z。数据的记录和处理通过MassHunter软件执行。
   
2. 代谢物的定量分析通过 LC-ESI-Q TRAP-MS/MS法多反应监测 (MRM) 模式进行分析。配备了ESI-Turbo离子喷雾接口的三重四极线性离子阱质谱仪 (Q TRAP)，API 4000 Q TRAP LC/MS/MS体系用于进行正离子模式下的线性三重四极 (QQQ) 扫描分析，Analyst 1.5 software (AB Sciex)。ESI源参数设置如下：离子源，涡轮喷雾；离子源温度，500 °C；离子喷雾电压 (IS)，5,500 V；离子源雾化气 (GSI)，辅助气 (GSII) 以及帘气气压分别为55，60和25.0 psi；碰撞气压 (CAD) 设置为高。在线性三重四极扫描模式下，分别用10和100 mol/L聚丙烯乙二醇进行仪器调谐和质量校准。
   

溶液配方

1. 乙酸水溶液
   1,000 ml纯水中加入0.4 ml乙酸
   
2. 0.04%乙腈溶液
   1,000 ml乙腈中加入0.4 ml乙酸
   

参考文献

1. Wang, S., Tu, H., Wan, J., Chen, W., Liu, X., Luo, J., Xu, J. and Zhang, H. (2016). Spatio-temporal distribution and natural variation of metabolites in citrus fruits. Food Chem 199: 8-17.
   
2. Wang, S., Yang, C., Tu, H., Zhou, J., Liu, X., Cheng, Y., Luo, J., Deng, X., Zhang, H. and Xu, J. (2017). Characterization and metabolic diversity of flavonoids in citrus species. Sci Rep 7(1): 10549.