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柑橘果实类胡萝卜素提取与检测   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理:类胡萝卜素是脂溶性物质,柑橘果实类胡萝卜素组分多样、含量丰富。用合适配比的极性相对较低的溶剂做提取剂和流动相,可以充分提取和分离不同组分和含量的类胡萝卜素。
实验目的:提取和检测柑橘果实类胡萝卜素< /b>,对其进行定性定量分析。

关键词: 柑橘果实, 类胡萝卜素, 高效液相色谱仪

材料与试剂

  1. 塑料吸管
  2. 10 ml离心管
  3. 50 ml离心管
  4. 1 ml注射器
  5. 0.22 μm有机滤膜 (抽滤流动相用)
  6. 0.22 μm滤膜 (过滤提取液用)
  7. Waters717检测器专用进样瓶
  8. 玻璃内插管
  9. 柑橘干样
  10. 正己烷 (分析纯)
  11. 丙酮 (分析纯)
  12. 无水乙醇 (分析纯)
  13. 10% NaCl
  14. 甲基叔丁基醚 (Methyl t-Butyl Ether, MTBE, 色谱纯)
  15. BHT (2,6-Di-bert-buty-4-methyl-phenol)
  16. 甲醇 (Methanol, 色谱纯)
  17. 乙腈 (Acetonitrile, 色谱纯)
  18. 类胡萝卜素提取液 (见溶液配方)
  19. 10% NaCl (见溶液配方)
  20. 10% KOH-甲醇皂化液 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 涡旋仪
  2. 磨样机
  3. 分液漏斗
  4. 超声仪
  5. 旋转蒸发仪 (Eppendorf, 德国)
  6. 真空抽滤仪
  7. 大型离心机
  8. 小离心机
  9. Waters高效液相色谱仪 (HPLC,high performance liquid chromatograph): 1525液相色谱泵系统、717自动进样器、2996二极管阵列检测器和Empower 2色谱管理软件,反向色谱柱C30 carotenoid column (长柱250 x 4.6 mm/短柱150 x 4.6 mm; YMC, Japan)

实验步骤

  1. 分别称取成熟柑橘干样1-3 g (红肉1 g, 白肉3 g;鲜样果肉粉末白肉品种10 g,红肉看色泽深度2-6 g不等,黄肉5 g;果皮粉末1-2 g) 置于50 ml离心管 (白色螺纹进口)。
  2. 加15 ml类胡萝卜素提取液,涡旋混匀。
  3. 磨样机剧烈震荡6分钟后4,000 x g离心10 min,转移上清至另一50 ml离心管 (普通离心管即可),沉淀用15 ml色素提取液重复提取两次至无色 (共提取三次,上清转移至同一离心管中)。
  4. 合并上清液,上清在50 ml的分液漏斗中用饱和NaCl (10%) 水溶液反复洗三次至中性,弃下层 (水层)。
  5. 将上清分批次转移至10 ml离心管中,真空浓缩干。真空浓缩后用2 ml MTBE (含0.1‰ BHT) 溶解,再加2 ml 10% KOH-甲醇溶液 (含0.1‰ BHT),避光条件下皂化10 h。
  6. 加4 ml饱和NaCl水溶液和2 ml MTBE (含0.1‰ BHT) 使之更好的分层,用胶头吸管吸走水层,再加3次5 ml饱和NaCl水溶液洗至中性。
  7. 将剩下的色素上清液分批次转移至2 ml离心管中,真空浓缩至干 (可暂时保存于-80 °C冰箱,待检测前再溶解),再用0.15-1 ml (浓度低的可只加0.15 ml,可以过滤膜) MTBE溶解定容。
  8. 15,871 x g离心30 min,过滤膜,转移到进样瓶中,高效液相色谱检测。
  9. 流动相的配制: A. 乙腈:甲醇=3:1 (750:250 ml,含0.01% BHT);B. 100% MTBE (含0.01% BHT)。
  10. 配好后分别用加有0.22 μm有机滤膜的真空抽滤仪,抽滤流动相,除去杂质。
  11. 流动相放超声仪中,超声30 min,除去气泡。

注意事项

  1. 以上色素提取,皂化等各操作均在弱光或避光条件下进行。
  2. 柑橘红色果肉中的番茄红素,易结晶,一定要充分稀释后再上样,否则容易堵柱子。
  3. 最后如果仅用0.15 ml的MTBE溶解时,用注射器加滤膜过滤提取液时,一定要在吸取提取液后多吸一段空气,并在操作台上干净的位置轻轻敲打,使液体充分进入滤膜后,在打进内插管,以保证把所有提取液都打进内插管中。
  4. HPLC的使用
    1)
    流动相:流速为1 ml/min,进样量20 µl。
    2)
    采用梯度洗脱:0 min: A-B(95:5); 0-10 min: A-B (95:5); 10-19 min: A-B (86:14); 19-29 min: A-B (75:25); 29-54 min: A-B (50:50); 54-66 min: A-B (26:74); 67-76 min: A-B (95:5)。
    3)
    数据分析:在304 nm波长看八氢番茄红素的结果,436 nm下看六氢番茄红素的结果,其余物质均可在450 nm下查看。
  5. 标准品峰图 (图1)


    图 1. 标准品峰图

  6. 标准品定性信息

溶液配方

  1. 类胡萝卜素提取液
    正己烷:丙酮:无水酒精=2:1:1 (500 ml, 250 ml, 250 ml; 含0.1‰ BHT)
  2. 10% NaCl
    100 g NaCl加到1 L纯水中
  3. 10% KOH-甲醇皂化液 (100 ml)
    10 g KOH,加25 ml超蒸水,再加75 ml甲醇
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:石梅艳, 徐娟. (2018). 柑橘果实类胡萝卜素提取与检测. Bio-101: e1010206. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010206.
How to cite: Shi, M. Y. and Xu, J. (2018). Extraction and Detection of Carotenoids from Citrus Fruits. Bio-101: e1010206. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010206.
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