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农杆菌感受态制备及转化   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理:在利用根癌农杆菌介导的基因遗传转化过程中,首先要得到携带目的基因载体的农杆菌菌株。细胞经过CaCl2处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞,即感受态细胞。农杆菌感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备,即用低渗CaCl2溶液在低温 (0 °C) 时处理快速生长的细菌,从而获得感受态。此时细菌膨胀成球形,外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面,通过热激作用促进细胞对DNA的吸收进而实现载体质粒的农杆菌转化。
实验目的:制备农杆菌感受态细胞,将表达载体质粒转 (以pK7WG2D_Cs7g29500-ox为例) 入农杆菌感受态细胞中,获得携带表达载体的农杆菌菌株用于基因遗传转化。

关键词: 农杆菌, 感受态, 制备, 热激转化

材料与试剂

  1. 各种型号枪头
  2. 各种型号离心管
  3. 吸水纸
  4. GV3101农杆菌菌株
  5. NaCl
  6. 胰蛋白胨
  7. 酵母提取物
  8. 琼脂粉
  9. 利福平 (50 mg/ml)
  10. CaCl2
  11. 壮观霉素
  12. 甘油
  13. 0.02 mol/L CaCl2 (见溶液配方)
  14. CaCl2/15%甘油混合液 (见溶液配方)
  15. LB培养基 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 恒温培养箱
  2. 超净工作台
  3. 恒温摇床
  4. 冷冻高速离心机
  5. -80 °C超低温冰箱
  6. 4 °C冰箱
  7. 分光光度计

实验步骤

  1. 农杆菌感受态制备
    1.1
    超低温冰箱中取出保存的GV3101农杆菌菌株于含50 mg/L的固体LB培养皿上划线,28 °C恒温培养箱培养48 h复苏。
    1.2
    挑取单菌落接种于含50 mg/L的液体LB培养基,28 °C、200 rpm摇床培养24 h (取出后可4 °C暂存)。
    1.3
    取2 ml菌液转入300 ml液体LB培养基培养至OD600 = 0.3~0.4(大约15~20 h,期间不时用分光光度计检测)。
    1.4
    将菌液全部转入50 ml离心管,冰浴30 min,同时冰浴0.02 mol/L CaCl2及CaCl2混合液。
    1.5
    将装有菌液的所有50 ml离心管放入4 °C离心机,5,000 x g离心5 min,倒去上清,灭菌吸水纸吸干残留液体。
    1.6
    每个离心管加入2 ml预冷的0.02 mol/L CaCl2重悬农杆菌 (先加1 ml吸打,再加1 ml),冰上放置20 min。
    1.7
    在4 °C、5,000 x g离心5 min。
    1.8
    去上清,加入2 ml CaCl2 + 15%甘油混合液,用1 ml移液器吸打混匀后,将多个50 ml离心管中的菌液集中到一个离心管,冰上冷冻,然后放到4 °C冰箱冷冻24 h。
    1.9
    冰上将菌液分装到无菌的1.5 ml离心管中,每管装100 μl,-80 °C超低温冰箱保存。
  2. 农杆菌热激转化
    2.1
    取5 μl pK7WG2D_Cs7g29500-ox终载体质粒 (约1-2 μg) 加入到100 μl农杆菌感受态细胞中混匀。
    2.2
    冰浴30 min,液氮速冻5 min,再37 °C水浴5 min,冰浴2 min。
    2.3
    加入800 μl液体LB培养基,28 °C、200 rpm摇床培养4-5 h。
    2.4
    吸取200 μl菌液涂在含50 mg/L壮观霉素的固体LB培养皿上,28 °C恒温培养箱培养48 h。
    2.5
    培养至有菌斑长出后,挑单克隆,阳性检测确认转化成功后扩繁菌液即可用于后续基因遗传转化。

注意事项

  1. 操作过程均为无菌操作,在超净工作台上完成。
  2. 常用农杆菌菌株主要有两种:GV3101 (多用于转化拟南芥和烟草)、EHA105 (多用于转化柑橘和愈伤组织)。

溶液配方

  1. 0.02 mol/L CaCl2
    0.22198 g CaCl2溶解于100 ml双蒸水中,121 °C、15 min灭菌
  2. CaCl2/15%甘油混合液
    0.1099 g CaCl2,7.5 ml甘油,加双蒸水定容至50 ml,121 °C、15 min灭菌
  3. LB培养基
    1 L固体LB培养基成分为10 g NaCl、10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、15 g琼脂粉,加水定容至1 L,121 °C、15 min灭菌。液体LB不加琼脂粉
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:徐远涛, 徐强. (2018). 农杆菌感受态制备及转化. Bio-101: e1010204. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010204.
How to cite: Xu, Y. T. and Xu, Q.  (2018). Preparation and Transformation of Agrobacterium Competent Cells. Bio-101: e1010204. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010204.
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