Preparation and Transformation of Agrobacterium Competent Cells   

材料与试剂

1. 各种型号枪头
   
2. 各种型号离心管
   
3. 吸水纸
   
4. GV3101农杆菌菌株
   
5. NaCl
   
6. 胰蛋白胨
7. 酵母提取物
8. 琼脂粉
9. 利福平 (50 mg/ml)
   
10. CaCl₂
    
11. 壮观霉素
    
12. 甘油
    
13. 0.02 mol/L CaCl₂ (见溶液配方)
    
14. CaCl₂/15%甘油混合液 (见溶液配方)
    
15. LB培养基 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 恒温培养箱
   
2. 超净工作台
   
3. 恒温摇床
   
4. 冷冻高速离心机
   
5. -80 °C超低温冰箱
   
6. 4 °C冰箱
   
7. 分光光度计
   

实验步骤

1. 农杆菌感受态制备
   1.1

   超低温冰箱中取出保存的GV3101农杆菌菌株于含50 mg/L的固体LB培养皿上划线，28 °C恒温培养箱培养48 h复苏。
   

   1.2

   挑取单菌落接种于含50 mg/L的液体LB培养基，28 °C、200 rpm摇床培养24 h (取出后可4 °C暂存)。
   

   1.3

   取2 ml菌液转入300 ml液体LB培养基培养至OD₆₀₀ = 0.3~0.4(大约15~20 h，期间不时用分光光度计检测)。
   

   1.4

   将菌液全部转入50 ml离心管，冰浴30 min，同时冰浴0.02 mol/L CaCl₂及CaCl₂混合液。
   

   1.5

   将装有菌液的所有50 ml离心管放入4 °C离心机，5,000 x g离心5 min，倒去上清，灭菌吸水纸吸干残留液体。
   

   1.6

   每个离心管加入2 ml预冷的0.02 mol/L CaCl₂重悬农杆菌 (先加1 ml吸打，再加1 ml)，冰上放置20 min。
   

   1.7

   在4 °C、5,000 x g离心5 min。
   

   1.8

   去上清，加入2 ml CaCl₂ + 15%甘油混合液，用1 ml移液器吸打混匀后，将多个50 ml离心管中的菌液集中到一个离心管，冰上冷冻，然后放到4 °C冰箱冷冻24 h。
   

   1.9

   冰上将菌液分装到无菌的1.5 ml离心管中，每管装100 μl，-80 °C超低温冰箱保存。
2. 农杆菌热激转化
   2.1

   取5 μl pK7WG2D_Cs7g29500-ox终载体质粒 (约1-2 μg) 加入到100 μl农杆菌感受态细胞中混匀。
   

   2.2

   冰浴30 min，液氮速冻5 min，再37 °C水浴5 min，冰浴2 min。
   

   2.3

   加入800 μl液体LB培养基，28 °C、200 rpm摇床培养4-5 h。
   

   2.4

   吸取200 μl菌液涂在含50 mg/L壮观霉素的固体LB培养皿上，28 °C恒温培养箱培养48 h。
   

   2.5

   培养至有菌斑长出后，挑单克隆，阳性检测确认转化成功后扩繁菌液即可用于后续基因遗传转化。

注意事项

1. 操作过程均为无菌操作，在超净工作台上完成。
   
2. 常用农杆菌菌株主要有两种：GV3101 (多用于转化拟南芥和烟草)、EHA105 (多用于转化柑橘和愈伤组织)。

溶液配方

1. 0.02 mol/L CaCl₂
   0.22198 g CaCl₂溶解于100 ml双蒸水中，121 °C、15 min灭菌
   
2. CaCl₂/15%甘油混合液
   0.1099 g CaCl₂，7.5 ml甘油，加双蒸水定容至50 ml，121 °C、15 min灭菌
   
3. LB培养基
   1 L固体LB培养基成分为10 g NaCl、10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、15 g琼脂粉，加水定容至1 L，121 °C、15 min灭菌。液体LB不加琼脂粉