农杆菌介导柑橘上胚轴稳定转化   

刘丹刘丹*王蓉 王蓉 *段艳欣 段艳欣 *郭文武 郭文武  (*contributed equally to this work)
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Original research article

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Rice Protocol e-book

实验原理:转基因技术作为20世纪后期兴起的的生物工程技术,因其可以导入一个或多个外源基因从而改变一个至多个性状,并且可以克服柑橘有性杂交不亲和、珠心胚等影响。本实验的目的是在柑橘已有的遗传转化方法基础上,进行相应调整,建立高效转化方法,提高获得阳性芽的效率。本实验对转绿10天的早花柠檬上胚轴进行侵染,随后在25 °C、光照条件下以卡那抗生素作为筛选剂进行筛选培养,50 d后获得稳定抗性再生芽,对抗性再生芽进一步诱导生根,炼苗移栽至温室,整个实验周期约为4个月。

关键词: 柑橘上胚轴, 农杆菌介导, 稳定转化

材料与试剂

  1. 滤纸
  2. 封口胶
  3. 橡皮筋
  4. 柑橘种子
  5. 75%酒精
  6. 次氯酸钠
  7. NaOH
  8. 蒸馏水
  9. 农杆菌菌株EHA105 (携带含目的基因载体)
  10. 6-Benzylaminopurine (6-BA) 
  11. Kinetin (KT) 
  12. Naphthalene acetic acid (NAA)
  13. Indole-3-acetic acid (IAA) 
  14. Kanamycin (Kan)
  15. Dimethyl Sulfoxide (DMSO)
  16. Acetosringone (AS) 
  17. Cephalosporins (Cef)
  18. 培养基母液 (详见柑橘组织培养常用培养基配制方法 [杨雯惠等,2018])
    1)
    肌醇储备液 (100x) 
    2)
    甘氨酸储备液 (100x) 
    3)
    微量储备液 (100x)
    4)
    大量储备液 (100x) 
    5)
    铁盐储备液 (100x) 
    6)
    Vitamin储备液 (100x)
  19. 激素类试剂母液 (见柑橘原生质体融合-电融合 [刘丹等,2018])
    1)
    6-BA储备液 (1 mg/ml)
    2)
    KT储备液 (1 mg/ml)
    3)
    IAA储备液 (1 mg/ml) 
    4)
    NAA储备液 (1 mg/ml)
  20. 培养基 (详见柑橘组织培养常用培养基配制方法 [杨雯惠等,2018])
    1)
    MT基本培养基
    2)
    MT播种培养基
    3)
    生芽培养基 
    4)
    MT悬浮培养基 
    5)
    生根培养基 
    6)
    LB培养基
  21. 50 mg/ml AS储备液 (见溶液配方)
  22. 400 mg/ml Cef储备液 (见溶液配方)
  23. 50 mg/ml Kan储备液 (见溶液配方)
  24. 共培养基 (见溶液配方)
  25. 筛选培养基 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 超净台
  2. 酒精灯
  3. 镊子
  4. 刀片
  5. 刀柄
  6. 平皿
  7. 三角瓶
  8. 摇床
  9. 培养箱
  10. 4 °C冷库
  11. -80 °C冰箱
  12. 离心机
  13. 紫外分光光度计
  14. 无菌过滤器

实验步骤

  1. 播种:柑橘果实完全成熟时进行采摘,之后进行单果包装,贮存在4 °C冷库中备用。使用时从柑橘果实中取出种子并将种子表面的果肉洗掉,将种子浸泡在1 mol/L NaOH中10 min去除表面果胶,之后用蒸馏水清洗3次,洗除NaOH。然后剥除外种皮,用浓度为3% (w/v) 的NaClO浸泡消毒15 min左右,用无菌水清洗至少3次,直至无菌水变无色,避免残留的NaClO对种子造成毒害作用。用镊子将消毒好的种子置于垫有滤纸的玻璃皿上去除内种皮,并接种于MT播种培养基上,封口置于暗下培养。
  2. 农杆菌划线活化:在侵染的前4 d,取带有目的基因的农杆菌 (-80 °C冰箱) 在含50 mg/ml kanamycin的LB培养基上划线活化,置于28 °C培养箱培养2 d。待长出单克隆后挑选单克隆,在含50 mg/ml kanamycin的LB培养基上划线,置于28 °C培养箱培养2 d。
  3. 农杆菌的侵染:侵染前,将活化的农杆菌刮入悬浮培养基 (见溶液配方) 中,悬浮培养基加入50 mg/ml AS (见溶液配方),28 °C,180-200 rpm震荡培养30 min-1 h,然后用悬浮培养基调节菌液浓度至OD600 = 0.6-0.7。
  4. 外植体-茎段的准备:将黄化苗从暗环境中取出,光下转绿只是7-10 d,待完全转绿后,从培养基中取出,铺于带有滤纸的大皿中,用刀尖斜切45°,保证茎段两端的切口方向一致,长度大约为1 cm左右,及时转移至悬浮培养基中 (防止茎段干枯)。
  5. 侵染与共培养:将茎段放入农杆菌悬浮液中,摇晃侵染10 min,静置10 min。倒掉菌液,用灭菌滤纸吸干茎段表面的菌液。随后将茎段转入表面覆盖有一层灭菌滤纸的共培养培养基 (见溶液配方),转入21 °C培养箱继续暗培养3 d。
  6. 清菌:共培养完成后,将茎段用镊子转移到空的灭菌容器 (建议口比较大的玻璃瓶,便于操作) 中。用含有400 mg/ml cef灭菌蒸馏水浸泡5 min,之后用灭菌蒸馏水反复清洗茎段3-5次,倒掉废液,用灭菌滤纸尽量吸干茎段表面的水分,平铺摆放在筛选培养基中,保证两端的切口朝上,同时每根茎段之间留有一定的空隙。最后,先在28 °C培养箱暗培养7 d,随后转移至光下培养。
  7. 生根:待再生芽长出至少两片叶子,且茎段有一定长度时,斜切下来,转移至生根培养基中,直至长出根系为止。
  8. 炼苗:再生完整根系后,挑选根系健壮、生长势好的再生苗炼苗2周,最后移栽到温室。

结果与分析



图1. 农杆菌介导柑橘上胚轴快速转化。A. 柑橘黄化苗;B. 切口再生芽;C和D为抗性再生芽;E和F为抗性再生植株;G. 诱导生根;H. 移栽至温室。

注意事项

  1. 由于种子保存在4 °C冰箱,一些染有内生菌的种子在播种时不易被识别,导致同一批次种子全部污染。因此首先要保证种子的质量,要求选用内生菌少且活力较高的种子。
  2. 黄化苗的状态很关键,当黄化苗从暗环境中取出置于光下转绿时,不同材料转绿所需时间也不相同,可自行判断。一定要选择长势好的黄化苗进行侵染。
  3. 侵染过程中,菌液浓度要求严格,最好控制在在0.6-0.7之间。
  4. 再生根系过程中,易长农杆菌,需及时清洗转移。

溶液配方

  1. 50 mg/ml AS储备液
    AS 1 g加入20 ml DMSO搅拌完全溶解,用有机无菌过滤器过滤,-20 °C保存
  2. 400 mg/ml Cef储备液
    Cef 20 g加入50 ml灭过菌的水中搅拌完全溶解,用水溶性无菌过滤器过滤,-20 °C保存
  3. 50 mg/ml Kan储备液
    Kan 1 g加入20 ml灭过菌的水中搅拌完全溶解,用水溶性无菌过滤器过滤,-20 °C保存
  4. 共培养基配制方法
    先配制生芽培养基,高压灭菌。之后放于微波炉中煮沸,待冷却至70 °C左右,按照1:1,000加入50 mg/ml AS,冷却,常温保存
  5. 筛选培养基配制方法
    先配制生芽培养基,高压灭菌。之后放于微波炉中煮沸,待冷却至70 °C左右,按照1:1,000加入400 mg/ml Cef和50 mg/ml Kan,冷却,常温保存

参考文献

  1. 刘丹,肖诗鑫,邓秀新,郭文武. (2018). 柑橘原生质体融合-电融合. Bio-101 e1010186. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010186.
  2. 杨雯惠,解凯东,郭文武. (2018). 柑橘组织培养常用培养基配制方法. Bio-101 e1010184. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010184.
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:刘丹, 王蓉 , 段艳欣 , 郭文武 . (2018). 农杆菌介导柑橘上胚轴稳定转化. Bio-101: e1010194. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010194.
How to cite: Liu, D., Wang, R., Duan, Y. X. and Guo, W. W. (2018). Agrobacterium-mediated Transformation of Citrus Using Epicotyl Sections. Bio-101: e1010194. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010194.
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