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农杆菌介导的籼稻遗传转化   

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实验原理:农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在一定条件下趋化性地感染植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒,它们都含有一段可转移的DNA(T-DNA),农杆菌通过侵染植物伤口,可以将T-DNA插入到植物基因组中,并且稳定的遗传给后代。本实验是把目的基因装载到经过改造的Ti质粒的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向水稻愈伤的转移与整合,然后通过组织培养技术,再生出转化植株。
实验目的:通过农杆菌介导的遗传转化把目的基因导入到籼稻品种中(MH63,ZS97,9311等)。

关键词: 籼稻, 根癌农杆菌, 遗传转化

材料与试剂

  1. 吸水纸
  2. 滤纸
  3. 大培养皿
  4. 小培养皿
  5. 封口膜
  6. Parafilm
  7. 接种环
  8. 籼稻种子
  9. EHA105农杆菌 (携带含目的基因载体)
  10. 乙醇
  11. 6-Benzylaminopurine (6-BA) (Sigma, catalog number: B-3408)
  12. Kinetin (KT) (Sigma, catalog number: K-0753)
  13. Naphthalene acetic acid (NAA) (Sigma, catalog number: N-0640)
  14. Indole-3-acetic acid (IAA) (Sigma, catalog number: I-2886)
  15. 2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) (Sigma, catalog number: D-7299)
  16. Kanamycin (USB, catalog number: 17924)
  17. Casein Enzymatic Hydrolysate (CH) (Sigma, catalog number: N-4642)
  18. Carbenicillin (Cn) (Bio Basic INC., catalog number: CDJ469)
  19. Hygromycin B (Hn) (Roche, catalog number: 10843555001)
  20. Nicotinic acid (Sigma, catalog number: N-0765)
  21. Pyridoxine HCl (VB6) (Sigma, catalog number: P-8666)
  22. Thiamine HCl (VB1) (Sigma, catalog number: T-3902)
  23. Inositol (Sigma, catalog number: I-3011)
  24. Phytagel (Sigma, catalog number: P-8169)
  25. Dimethyl Sulfoxide (DMSO) (Sigma, catalog number: D-5879)
  26. Acetosringone (AS) (Aldrich chem., CO 01531 EG)
  27. Proline
  28. Sucrose
  29. Agar powder
  30. D-sorbitol
  31. NH4NO3
  32. KNO3
  33. KH2PO4
  34. MgSO4∙7H2O
  35. CaCl2
  36. CaCl2∙2H2O
  37. MnSO4∙4H2O
  38. ZnSO4∙7H2O
  39. H3BO3
  40. KI
  41. Na2MoO4∙2H2O
  42. CoCl2∙6H2O
  43. CuSO4∙5H2O
  44. (NH4)2SO4
  45. FeSO4∙7H2O
  46. Na2 EDTA∙2H2O
  47. Glycine
  48. KOH
  49. HgCl2
  50. Glucose
  51. MSmax储备液(10x) (见溶液配方)
  52. MSmin储备液(100x) (见溶液配方)
  53. N6max储备液(10x) (见溶液配方)
  54. N6min储备液(100x) (见溶液配方)
  55. Fe2+-EDTA储备液(100x) (见溶液配方)
  56. Vitamin储备液(100x) (见溶液配方)
  57. 6-BA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  58. KT储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  59. 2, 4-D储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  60. IAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  61. NAA储备液(1 mg/ml) (见溶液配方)
  62. 200 mM AS储备液(见溶液配方)
  63. 1 N KOH储备液(见溶液配方)
  64. 0.15% HgCl2 (见溶液配方)
  65. 50%葡萄糖(见溶液配方)
  66. 250 mg/ml CN (见溶液配方)
  67. 50 mg/ml Kan (见溶液配方)
  68. 诱导培养基(见溶液配方)
  69. 继代培养基(见溶液配方)
  70. 预培养基(见溶液配方)
  71. 悬浮培养基(见溶液配方)
  72. 共培养基(见溶液配方)
  73. 筛选培养基(见溶液配方)
  74. 预分化培养基(见溶液配方)
  75. 分化培养基(见溶液配方)
  76. 生根培养基(见溶液配方)
    注:以上所有常规试剂都是由国药化工和光复科技提供。

仪器设备

  1. 超净工作台
  2. 100 ml三角瓶
  3. 250 ml三角瓶
  4. 500 ml三角瓶
  5. 生根管
  6. 剪刀
  7. 镊子
  8. 小铁勺
  9. 酒精灯
  10. 28 °C摇床
  11. 19 °C培养箱

实验步骤

  1. 诱导愈伤
    1.1
    成熟种子去掉颖壳,用75%乙醇浸泡1 min,然后用0.15% HgCl2浸泡15-20 min,最后用无菌蒸馏水漂洗4~5次。
    1.2
    每瓶诱导培养基 (见溶液配方) 接入8~10粒种子,26 °C暗培养35 d。
  2. 继代
    2.1
    提前2~3 d准备好继代培养基 (见溶液配方),使培养基干燥。
    2.2
    用镊子将新长出来的愈伤夹成小块,转入新的继代培养基中,每瓶约20粒,在26°C恒温暗室培养20 d后,可以长出颜色鲜黄直径约为为2~3 mm的胚性愈伤组织颗粒。大小合适的愈伤可以进行预培养,小的就进行第二次继代。
  3. 预培养
    3.1
    每250 ml预培养基 (见溶液配方) 中加入250 μl AS与5 ml 50% (w/v)葡萄糖并倒皿,每瓶培养基倒8~10个皿。
    3.2
    选取自然分散,颜色鲜黄,直径约为2~3 mm的胚性愈伤组织颗粒转入预培养基中,每皿为80粒愈伤颗粒,在26 °C恒温暗培养4 d。
  4. 侵染
    4.1
    提前将含有目的基因的农杆菌菌株划线活化 (28 °C培养36-48 h)。
    4.2
    准备灭菌的悬浮培养基 (见溶液配方),共培养基 (见溶液配方),大培养皿,小培养皿 (里面垫有吸水纸和滤纸,用前灭菌并置于80 °C烘干),250 ml无菌三角瓶若干。
    4.3
    将划线培养的农杆菌刮入悬浮培养基(每100 ml培养基加入100 μl AS),28 °C,200 rpm振荡培养2~3 h,然后调整菌液浓度至OD600≈0.5。
    4.4
    收集预培养的愈伤组织到250 ml的无菌三角瓶中;然后把培养好的农杆菌菌液倒入装有愈伤组织的三角瓶中,浸泡30 min。
    4.5
    浸泡完后,先倒掉菌液,将装有愈伤组织的三角瓶倒扣于装有滤纸的无菌小皿上,沥干菌液,再把愈伤颗粒铺在装有7层以上滤纸的无菌大皿上,从下面抽一张无菌滤纸盖在愈伤上,用镊子轻压愈伤吸干表面菌液,弃掉上面滤纸,重复上述工作至少4次,最后在愈伤颗粒上盖一张滤纸,盖好大皿,自然干燥2 h。
    4.6
    愈伤干燥时,每250 ml共培养基中加入250 μl AS和5 ml 50% (w/v)葡萄糖并倒皿,每瓶培养基倒8~10个平皿。
    4.7
    用无菌勺子将充分干燥的愈伤组织均匀地平铺在共培养基上 (铺上之后不要再挪动,减少培养基与愈伤表面的接触,防止农杆菌的过度生长),用Parafilm封口。
    4.8
    19 °C暗培养3 d。
  5. 水洗与筛选
    5.1
    准备无菌蒸馏水,大、小皿 (含有吸水纸和滤纸,灭菌后置于80 °C烘干),250 ml三角瓶若干,筛选培养基。
    5.2
    用无菌勺子将共培养完成后的愈伤颗粒收集到250 ml的三角瓶中,用无菌的蒸馏水清洗6次以上,直至倒出的蒸馏水清亮即可,最后加150 ml蒸馏水,以及300 μl Cn,室温浸泡30 min。
    5.3
    浸泡完后,先倒掉菌液,将装有愈伤组织的三角瓶倒扣于装有滤纸的无菌小皿上,沥干菌液,再把愈伤颗粒铺在装有7层以上滤纸的无菌大皿上,从下面抽一张无菌滤纸盖在愈伤上,用镊子轻压愈伤吸干表面菌液,弃掉上面滤纸,重复上述工作至少4次,最后在愈伤颗粒上盖一张滤纸,盖好大皿,自然干燥2 h。
    5.4
    愈伤干燥时,将每250 ml筛选培养基中加入400 μl Cn与250 μl Hn (终浓度400 mg/L Cn和50 mg/L Hn),然后倒8~9个平皿。
    5.5
    将干燥后的愈伤颗粒转移到筛选培养基(S1)中,每皿摆放约40颗愈伤,暗室26 °C恒温培养15 d。
  6. 第二次筛选(S2)
    6.1
    准备筛选培养基(见溶液配方),每250 ml培养基中加入300 μl Cn和250 μl Hn (终浓度300 mg/L Cn和50 mg/L Hn),倒8~9个平皿。
    6.2
    将S1培养基上干燥的,没有农杆菌污染的愈伤颗粒转接到新的筛选培养基(S2)上,每皿摆放约25粒;暗室26 °C恒温培养20 d。
    6.3
    在此期间,观察是否长出新鲜嫩黄的抗性愈伤,如果没有抗性愈伤出现,把愈伤组织转接到新的筛选培养基上(S3),S3筛选培养基除Cn浓度适当降低(终浓度250 mg/L)外其他同S2。继续暗室26 °C恒温培养,直至长出新的抗性愈伤。
  7. 分化
    7.1
    从筛选培养基中将抗性愈伤(每一团只挑一颗抗性愈伤)转移至预分化培养基 (见溶液配方)中(含50 mg/L Hn和200 mg/L Cn),暗室26 °C恒温培养一周。
    7.2
    从预分化培养基中挑选无褐化死亡的抗性愈伤转移到分化培养基 (见溶液配方) 中,28 °C、光照14 h/黑暗10 h培养30~35 d。通常一周后愈伤开始转绿,三周后开始长出幼芽。
  8. 生根
    准备装有1/4生根培养基(见溶液配方)的生根管。从分化培养基中挑出幼苗 (同一块愈伤组织若分化出多株幼苗,则挑选长势最好的一株),用灭菌的剪刀剪去老根和周围附着的愈伤,然后接入生根管内,28 °C、光照14 h/黑暗10 h培养10~20 d (根据幼苗大小决定生长时间)。
  9. 炼苗与移栽
    生根完成后开盖,加入自来水继续培养3 d,然后取出再生植株用水洗掉生根培养基,修剪根部和叶部,移栽到温室。

注意事项

  1. 整套过程必须在无菌条件下操作,尽量做到少污染。
  2. 污染的材料要求及时清理,以免扩大污染。
  3. 尽量挑取活力强的愈伤进行试验。
  4. 在整个转化过程中,愈伤组织或者分化后的幼苗长至适当状态,应当尽快进行下一步操作 (尽量减少组织培养时间可减少体细胞突变)。

溶液配方

一、溶液配置

  1. MSmax储备液(10x)
    NH4NO3
    16.5 g
    KNO3
    19.0 g
    KH2PO4
    1.7 g
    MgSO4·7H2O
    3.7 g
    CaCl2
    3.32 g or CaCl2∙2H2O 4.4 g
    逐个溶解,然后加蒸馏水定容至1 L。
  2. MSmin储备液(100x)
    MnSO4·4H2O
    2.23 g
    ZnSO4·7H2O
    0.86 g
    H3BO3
    0.62 g
    KI
    0.083 g
    Na2MoO4·2H2O
    0.025 g
    CoCl2·6H2O
    0.0025 g
    CuSO4·5H2O
    0.0025 g
    注:Na2MoO4·2H2O必须单独溶解,再与其它组分混合,加蒸馏水定容到1 L,室温保存。
  3. N6max储备液(10x)
    KNO3
    28.3 g
    KH2PO4
    4.0 g
    (NH4)2SO4
    4.63 g
    MgSO4∙7H2O
    1.85 g
    CaCl2
    1.25 g or CaCl2∙2H2O 1.66 g
    逐个溶解,然后加蒸馏水定容到1 L。
  4. 继代A储备液(10x)
    NH4NO3
    17 g
    KNO3
    19.0 g
    KH2PO4
    1.7 g
    MgSO4·7H2O
    3.7 g
    CaCl2
    3.02 g or CaCl2∙2H2O 4 g
    逐个溶解,然后加蒸馏水定容至1 L。
  5. 继代B储备液(100x)
    MnSO4·4H2O
    10 g
    ZnSO4·7H2O
    2 g
    H3BO3
    3 g
    KI
    0.75 g
    Na2MoO4·2H2O
    0.25 g
    CoCl2·6H2O
    0.025 g
    CuSO4·5H2O
    0.025 g
    注:Na2MoO4·2H2O必须单独溶解,再与其它组分混合,加蒸馏水定容至1 L,4°C保存。
  6. Fe2+-EDTA储备液(100x)
    在一个试剂瓶中加入300 ml蒸馏水,然后加入
    FeSO4∙7H2O
    2.78 g
    在另一试剂瓶中加入300 ml蒸馏水,并加热到70 °C,然后加入
    Na2 EDTA∙2H2O
    3.73 g
    都溶解好后,将两个试剂瓶中的溶液混合,70 °C保温2 h,然后加入蒸馏水定容至1 L,4 °C避光保存。
  7. Vitamin储备液(100x)
    Nicotinic acid
    0.1 g
    Pyridoxine HCl (VB6)
    0.1 g
    Thiamine HCl (VB1)
    0.1 g
    Glycine
    0.2 g
    Inositol
    10 g
    加蒸馏水定容到1 L,4 °C避光保存。
  8. AAmax储备液(10x)
    KCl
    29.5 g
    MgSO4·7H2O
    2.5 g
    NaH2PO4
    1.5 g
    CaCl2∙2H2O
    1.5 g
    加蒸馏水定容到1 L,室温避光保存。
  9. AAmin储备液(100x)
    MnSO4∙H2O
    1.0 g
    H3BO3
    0.3 g
    ZnSO4∙7H2O
    0.2 g
    KI
    0.075 g
    Na2MoO4∙2H2O
    0.025 g
    CuSO4∙5H2O
    0.0025 g
    CoCl2∙6H2O
    0.0025 g
    注:Na2MoO4单独溶解,然后与其它组分混合并加蒸馏水定容至1 L,室温避光保存。
  10. 6-BA储备液(1 mg/ml)
    6-BA
    100 mg
    加入1.0 ml 1 N KOH搅拌至6-BA完全溶解,然后加蒸馏水定容到100 ml,室温保存。
  11. KT储备液(1 mg/ml)
    KT
    100 mg
    加入1.0 ml 1 N KOH搅拌至KT完全溶解,然后加蒸馏水定容到100 ml,室温保存。
  12. 2, 4-D储备液(1 mg/ml)
    2, 4-D
    100 mg
    加入1.0 ml 1N KOH搅拌5 min,然后加10 ml蒸馏水搅拌至2,4-D完全溶解,用蒸馏水定容至100 ml,室温保存。
  13. IAA储备液(1 mg/ml)
    IAA
    100 mg
    加入1.0 ml 1N KOH搅拌至IAA完全溶解,然后用蒸馏水定容至100 ml,室温避光保存。
  14. NAA储备液(1 mg/ml)
    NAA
    100 mg
    加入1.0 ml 1N KOH搅拌至NAA完全溶解,然后用蒸馏水定容到100 ml,室温避光保存。
  15. 100 mM AS储备液
    AS
    0.196 g
    DMSO
    10 ml
    用1.5 ml离心管分装,4 °C保存。
  16. 1 N KOH储备液
    KOH
    5.6 g
    用100 ml蒸馏水溶解,室温保存。
  17. 0.15% HgCl2
    HgCl2
    1.5 g
    先加600 ml蒸馏水完全溶解,再加入100 μl吐温20,然后用蒸馏水定容至1 L。
  18. 50%葡萄糖
    Glucose
    25 g
    加蒸馏水溶解后定容至50 ml,高压灭菌后4 °C保存。
  19. Carbenicillin (Cn)
    Carbenicillin
    1 g
    加ddH2O定容至4 ml,分装至1.5 ml离心管,-20 °C保存。

二、培养基配置 
  1. 诱导培养基
    MSmax储备液(10x)
    100 ml
    MSmin储备液(100x)
    10 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)
    10 ml
    Vitamin储备液(100x)
    10 ml
    2, 4-D储备液
    2.5 ml
    Proline
    0.5 g
    Glutamine
    0.5 g
    Casein Enzymatic Hydrolysate
    0.6 g
    Sucrose
    30 g
    Phytagel
    3 g
    先加入900 mL蒸馏水,用1 N KOH调至pH值为6.0,加蒸馏水定容至1 L,然后煮沸分装至100 ml三角瓶,高压灭菌。
  2. 继代培养基
    继代A储备液(10x)
    100 ml
    继代B储备液(100x)
    10 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)
    10 ml
    Vitamin储备液(100x)
    10 ml
    2, 4-D储备液
    3.0 ml
    Proline
    0.6 g
    Glutamine
    0.5 g
    Casein Enzymatic Hydrolysate
    0.8 g
    Maltose
    30 g
    Phytagel
    3.0 g
    先加入900 ml蒸馏水,用1 N KOH调至pH值为6.0,加蒸馏水定容至1 L,然后煮沸分装至100 ml三角瓶,高压灭菌。
  3. 预培养基
    MSmax储备液(10x)
    12.5 ml
    MSmin储备液(100x)
    1.25 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)
    1.25 ml
    Vitamin储备液(100x)
    1.25 ml
    2, 4-D储备液
    0.75 ml
    Maltose
    5.0 g
    Agarose
    1.75 g
    先加入200 ml蒸馏水,用1 N KOH调至pH值为5.6,加蒸馏水定容至250 ml,高压灭菌。使用之前加入5 ml 50%葡萄糖与250 μl AS储备液。
  4. 悬浮培养基
    AAmax储备液(10x)
    10 ml
    AAmin储备液(100x)
    1 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)
    1 ml
    Vitamin储备液(100x)
    1 ml
    2, 4-D储备液
    0.2 ml
    Glutamine
    0.0876 g
    Asparagine
    0.0216 g
    Arginine
    0.0176 g
    Maltose
    2 g
    Glucose
    1 g
    用1 N KOH调至pH值为5.4,加蒸馏水定容至100 ml,高压灭菌,使用时加入100 μl AS储备液。
  5. 共培养基
    MSmax储备液(10x)
    6.25 ml
    MSmin储备液(100x)
    1.25 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)
    2.5 ml
    Vitamin储备液(100x)
    2.5 ml
    2, 4-D储备液
    0.75 ml
    Casein Enzymatic Hydrolysate
    0.2 g
    Maltose
    5.0 g
    Agarose
    1.75 g
    先加入200 ml蒸馏水,用1 N KOH调至pH值为5.4,加蒸馏水定容至250 ml,高压灭菌。使用之前加入5 ml 50%葡萄糖与250 μl AS储备液。
  6. 筛选培养基
    继代A储备液(10x)
    25 ml
    继代B储备液(100x)
    2.5 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)
    2.5 ml
    Vitamin储备液(100x)
    2.5 ml
    2, 4-D储备液
    0.625 ml
    Proline
    0.15 g
    Glutamine
    0.1 g
    Casein Enzymatic Hydrolysate
    0.15 g
    Maltose
    7.5 g
    Agarose
    1.75 g
    先加入200 ml蒸馏水,用1 N KOH调至pH值为6.0,加蒸馏水定容至250 ml,高压灭菌。
  7. 预分化培养基
    N6max储备液(10x)
    25 ml
    继代B储备液(100x)
    2.5 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)
    2.5 ml
    Vitamin储备液(100x)
    2.5 ml
    6-BA储备液
    0.5 ml
    KT储备液
    0.5 ml
    NAA储备液
    50 μl
    IAA储备液
    50 μl
    Proline
    0.15 g
    Casein Enzymatic Hydrolysate
    0.15 g
    Maltose
    5.0 g
    Sucrose
    2.5 g
    Agarose
    1.75 g
    先加入200 ml蒸馏水,用1 N KOH调至pH值为5.9,加蒸馏水定容至250 ml,高压灭菌。
  8. 分化培养基
    N6max储备液(10x)
    100 ml
    继代B储备液(100x)
    6 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)10  ml
    Vitamin储备液(100x)
    10 ml
    6-BA储备液 2.0 ml
    KT储备液
    2.0 ml
    IAA储备液 0.2 ml
    NAA储备液 0.2 ml
    Proline
    0.6 g
    Casein Enzymatic Hydrolysate 1 g
    Maltose
    20 g
    Sucrose
    10 g
    Agarose 3.0 g
    先加入900 ml蒸馏水,用1 N KOH调至pH值为6.0,补蒸馏水定容至1 L,然后煮沸分装至100 ml三角瓶,高压灭菌。
  9. 生根培养基
    MSmax储备液(10x)
    50 ml
    MSmin储备液(100x)
    5 ml
    Fe2+-EDTA储备液(100x)
    10 ml
    Vitamin储备液(100x)
    10 ml
    Sucrose
    20 g
    Phytagel
    3 g
    先加入900 ml蒸馏水,用1 N KOH调至pH值为5.8,加蒸馏水定容至1 L,然后煮沸分装至生根管,高压灭菌。
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:刘瑜, 凌飞, 林拥军, 陈浩. (2018). 农杆菌介导的籼稻遗传转化. Bio-101: e1010175. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010175.
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