水稻叶表皮蜡质分离和检测   

材料与试剂

1. 1.5 ml离心管
   
2. 50 ml离心管
   
3. 冰盒
   
4. 溶剂
   正己烷 (Sigma, catalog number: 34859)
   Pyridine (Sigma, catalog number: 270407)
   
5. 衍生化试剂
   BSTFA (Fluka, catalog number: 15238)
   
6. 蜡质标准品
   烷酸：C16:0-C28:0 (Sigma)
   烷烃：C27-C33 (Sigma)
   烷醇：C24OH-C30OH (Sigma)
   内标：C24、C19:0(Sigma)
   注：所有试剂均为色谱纯级别。
   

仪器设备

1. 水浴锅 (国产)
   
2. 氮吹仪 (Dry N-EVAPTM111, Organomation Associates Inc. USA)
   
3. 气相色谱－质谱联用仪 (GCMS-QP2010Plus; Shimadzu)
   
4. 气相色谱柱 (30 m Restek Rxi-5ms, 0.25 mm ID, 0.25 μm df)
   
5. 色谱上样瓶 (Agilent)
   

实验步骤

1. 从正常生长或处理后的水稻植株上剪取叶片样品100-500 mg，保持叶片完整，放入冰盒保鲜带回实验室。
   
2. 50 ml干净离心管中加入30 ml正己烷，置于水浴中加热至67 °C。将所取叶片样品夹取浸没入已加热好的正己烷中，抽提30 sec，表皮蜡质即溶入正己烷溶液。
   
3. 向抽提好的蜡质正己烷溶液中加入50 μg的正二十四烷(C24)和正十九酸(C19:0)作为内标。
   
4. 使用氮吹仪将蜡质溶液浓缩至10 ml以内，将剩余溶液加入至新的1.5 ml进口离心管中于氮吹仪下继续浓缩并吹干样品。
   
5. 向吹干的样品管中加入40 μl的Pyridine和40 μl的BSTFA溶解样品并进行后续的衍生化，100 °C衍生化30 min。
   
6. 将衍生化后的样品于氮吹仪下再次吹干，然后加入1 ml正己烷重新溶解混匀样品。
   
7. 溶解完全后的蜡质样品转移至玻璃上样瓶中，以待GC/MS上样检测。
   
8. 标准曲线配置：将各种蜡质成份标准品用正己烷溶解加入到1.5 ml进口离心管中至50 ppm~500 ppm等梯度，并加入如上样品等量的内标，经过同样的衍生化后重溶并转入玻璃上样瓶中待测。
   
9. GC/MS上机分析
   色谱柱升温程序：柱始温50 °C，保持2 min；40 °C/min升温至200 °C，200 °C保持2 min；然后3 °C/min升温至300 °C，保持15 min。
   
10. 结果分析：对测出的蜡质各组分进行峰面积积分，并参比内标量和标准曲线梯度对样品中的各组分进行定量。
    

注意事项

1. 蜡质抽提步骤应于通风橱中进行。抽提过程中叶片切口避免没入有机溶剂中，并严格控制抽提时间，以免细胞的膜脂成分溶入溶剂中。
   
2. 氯仿同样可用做蜡质抽提溶剂，抽提温度则为60 °C，最好使用色谱纯的。
   
3. 处理好的上样样品放置时间不能过长，应立即测定，保存时间过长容易导致蜡质成份出现沉淀而难以再溶解，并且其中成分性质也会发生改变。
   
4. 抽提及衍生化过程最好都在玻璃容器中进行。
   

1. 朱晓义, 刘红波, 熊立仲. (2018). 水稻叶表皮蜡质分离和检测. Bio-101: e1010155. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010155.