水稻叶表皮蜡质分离和检测   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理:利用有机溶剂(正己烷或氯仿等)分离和溶解植物表皮蜡质,并使用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)系统对衍生化的蜡质成份进行组分分离、定性和定量。
实验目的:检测表皮蜡质中各组分的含量,包括脂肪酸、长链烷烃、脂肪醇和醛等,可用于分析因蜡质成分变化而导致的表皮缺陷表型等。

关键词: 水稻, 叶表皮, 蜡质

材料与试剂

  1. 1.5 ml离心管
  2. 50 ml离心管
  3. 冰盒
  4. 溶剂
    正己烷 (Sigma, catalog number: 34859)
    Pyridine (Sigma, catalog number: 270407)
  5. 衍生化试剂
    BSTFA (Fluka, catalog number: 15238)
  6. 蜡质标准品
    烷酸:C16:0-C28:0 (Sigma)
    烷烃:C27-C33 (Sigma)
    烷醇:C24OH-C30OH (Sigma)
    内标:C24、C19:0(Sigma)
    注:所有试剂均为色谱纯级别。

仪器设备

  1. 水浴锅 (国产)
  2. 氮吹仪 (Dry N-EVAPTM111, Organomation Associates Inc. USA)
  3. 气相色谱-质谱联用仪 (GCMS-QP2010Plus; Shimadzu)
  4. 气相色谱柱 (30 m Restek Rxi-5ms, 0.25 mm ID, 0.25 μm df)
  5. 色谱上样瓶 (Agilent)

实验步骤

  1. 从正常生长或处理后的水稻植株上剪取叶片样品100-500 mg,保持叶片完整,放入冰盒保鲜带回实验室。
  2. 50 ml干净离心管中加入30 ml正己烷,置于水浴中加热至67 °C。将所取叶片样品夹取浸没入已加热好的正己烷中,抽提30 sec,表皮蜡质即溶入正己烷溶液。
  3. 向抽提好的蜡质正己烷溶液中加入50 μg的正二十四烷(C24)和正十九酸(C19:0)作为内标。
  4. 使用氮吹仪将蜡质溶液浓缩至10 ml以内,将剩余溶液加入至新的1.5 ml进口离心管中于氮吹仪下继续浓缩并吹干样品。
  5. 向吹干的样品管中加入40 μl的Pyridine和40 μl的BSTFA溶解样品并进行后续的衍生化,100 °C衍生化30 min。
  6. 将衍生化后的样品于氮吹仪下再次吹干,然后加入1 ml正己烷重新溶解混匀样品。
  7. 溶解完全后的蜡质样品转移至玻璃上样瓶中,以待GC/MS上样检测。
  8. 标准曲线配置:将各种蜡质成份标准品用正己烷溶解加入到1.5 ml进口离心管中至50 ppm~500 ppm等梯度,并加入如上样品等量的内标,经过同样的衍生化后重溶并转入玻璃上样瓶中待测。
  9. GC/MS上机分析
    色谱柱升温程序:柱始温50 °C,保持2 min;40 °C/min升温至200 °C,200 °C保持2 min;然后3 °C/min升温至300 °C,保持15 min。
  10. 结果分析:对测出的蜡质各组分进行峰面积积分,并参比内标量和标准曲线梯度对样品中的各组分进行定量。

注意事项

  1. 蜡质抽提步骤应于通风橱中进行。抽提过程中叶片切口避免没入有机溶剂中,并严格控制抽提时间,以免细胞的膜脂成分溶入溶剂中。
  2. 氯仿同样可用做蜡质抽提溶剂,抽提温度则为60 °C,最好使用色谱纯的。
  3. 处理好的上样样品放置时间不能过长,应立即测定,保存时间过长容易导致蜡质成份出现沉淀而难以再溶解,并且其中成分性质也会发生改变。
  4. 抽提及衍生化过程最好都在玻璃容器中进行。
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:朱晓义, 刘红波, 熊立仲. (2018). 水稻叶表皮蜡质分离和检测. Bio-101: e1010155. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010155.
How to cite: Zhu, X. Y., Liu, H. B. and Xiong, L. Z. (2018). Isolation and Detection of Rice Leaf Epidermis Waxy. Bio-101: e1010155. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010155.
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