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水稻叶片中黄酮类代谢产物的检测和鉴定   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验原理:黄酮是一类常见的次生代谢产物,它们广泛地存在于自然界中某些植物体内,并且具有多种生物活性,最主要包括抗氧化、抗病菌等。高效液相色谱有对代谢物进行分离的功能,质谱可以对代谢物进行鉴定,对于水稻叶片中大量的黄酮类物质,可以利用高效液相色谱-质谱联用技术进行检测和鉴定。
实验目的:通过液相色谱-质谱联用技术对水稻叶片中常见的15种黄酮进行检测和鉴定。

关键词: 水稻, 代谢物, 液相色谱-质谱联用

材料与试剂

  1. 离心管
  2. 0.22 μm尼龙膜 (上海安谱科学仪器有限公司)
  3. 各种型号的枪头
  4. 色谱进样样品管
  5. 甲醇和乙酸,色谱纯级别 (来自德国Merck公司)
  6. 双蒸水

仪器设备

  1. 色谱仪 (岛津UFLC shimADZU色谱仪)
  2. 色谱柱 (shimpack VP-ODS,150 mm * 5 μm)
  3. 涡旋仪
  4. 4 °C冰箱
  5. 离心机
  6. -70 °C冰箱

实验步骤

  1. 样品制备
    1.1
    取适量(3-5片)新鲜水稻叶片,液氮保存;
    1.2
    配制70%的甲醇溶液用于黄酮的提取;
    1.3
    在研钵中用液氮将水稻叶片磨成粉状后加入预冻好的离心管中,然后按1 g:1 ml的比例加入70%甲醇溶液,强烈涡旋10 s后将样品放入4 °C冰箱,每隔10 min再涡旋一次,重复3次后放入4 °C冰箱过夜。
    1.4
    次日用4 °C离心机10,000 rpm离心10 min后吸取上清,然后用0.22 μm尼龙膜将上清液过滤后装入色谱进样样品管中,放-70 °C冰箱保存,待测。

  2. 按照以下所描述的仪器条件准备好仪器,以便对黄酮进行检测
    2.1
    高效液相色谱条件
    流动相:A(水相)为体积比为0.04%乙酸水溶液,B(有机相)为体积比为0.04%乙酸甲醇溶液,柱温40 °C,流速0.25 ml/min;
    进样量:5 μl;
    洗脱梯度:0.1 min = 25% B;15 min = 50% B;18-23 min = 75% B;23.1 min = 25% B;33 min = stop。
    2.2
    质谱条件
    质谱仪:AB API 4,000 Q TRAP串联四极杆线性离子阱质谱仪。
    仪器参数:离子源:Turbo V;电离模式:ESI(+)

  3. 建立一个多反应监测模式(MRM)的跑样方法,并按照(表1)内容导入所需要检测的黄酮物质

    表1.检测水稻叶片中常见15种黄酮的相关参数


  4. 用已建立好的方法对要分析的样品进样跑样,完成后对结果进行分析

结果与分析

  • 结果如图1所示,每个物质的保留时间及物质名称如表2所示


    图1. 叶片中15种常见黄酮的峰图

    表2.水稻叶片中15中常见黄酮的保留时间及物质名称

    注意事项

    1. 最终可以根据标样做标准曲线对这些黄酮进行绝对定量;也可以对峰面积进行积分从而在不同的水稻样品中进行相对定量,并进一步进行相对含量的比较和分析。
    2. 如图2是Cyanidin 3-O-glucoside在几个常规品种剑叶中的相对含量分布,可以看出,ZS97中Cyanidin 3-O-glucoside的含量远远高于其他品种,甚至是有和无的差别,从表型观察我们也可以发现ZS97的叶缘为紫色,而其他几个品种为绿色,据报道,Cyanidin 3-O-glucoside正是导致水稻叶片颜色出现紫色最主要的物质之一。


      图2. Cyanidin 3-O-glucoside在几种常规品种剑叶中的相对含量分布

    参考文献

    1. Chen, W., Gong, L., Guo, Z., Wang, W., Zhang, H., Liu, X., Yu, S., Xiong, L. and Luo, J. (2013). A novel integrated method for large-scale detection, identification, and quantification of widely targeted metabolites: application in the study of rice metabolomics. Mol Plant 6(6): 1769-1780.
    2. Gong, L., Chen, W., Gao, Y., Liu, X., Zhang, H., Xu, C., Yu, S., Zhang, Q. and Luo, J. (2013). Genetic analysis of the metabolome exemplified using a rice population. Proc Natl Acad Sci U S A 110(50): 20320-20325.
  • Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
    引用格式:龚亮, 陈伟, 罗杰. (2018). 水稻叶片中黄酮类代谢产物的检测和鉴定. Bio-101: e1010153. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010153.
    How to cite: Gong, L., Chen, W. and Luo, J. (2018). Detection and Identification of Flavonoid Metabolites in Rice Leaves. Bio-101: e1010153. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010153.
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