水稻叶片中黄酮类代谢产物的检测和鉴定   

材料与试剂

1. 离心管
   
2. 0.22 μm尼龙膜 (上海安谱科学仪器有限公司)
   
3. 各种型号的枪头
   
4. 色谱进样样品管
   
5. 甲醇和乙酸，色谱纯级别 (来自德国Merck公司)
   
6. 双蒸水

仪器设备

1. 色谱仪 (岛津UFLC shimADZU色谱仪)
   
2. 色谱柱 (shimpack VP-ODS，150 mm * 5 μm)
   
3. 涡旋仪
   
4. 4 °C冰箱
   
5. 离心机
   
6. -70 °C冰箱

实验步骤

1. 样品制备
   1.1

   取适量(3-5片)新鲜水稻叶片，液氮保存；
   
   1.2

   配制70%的甲醇溶液用于黄酮的提取；
   
   1.3

   在研钵中用液氮将水稻叶片磨成粉状后加入预冻好的离心管中，然后按1 g:1 ml的比例加入70%甲醇溶液，强烈涡旋10 s后将样品放入4 °C冰箱，每隔10 min再涡旋一次，重复3次后放入4 °C冰箱过夜。
   
   1.4

   次日用4 °C离心机10,000 rpm离心10 min后吸取上清，然后用0.22 μm尼龙膜将上清液过滤后装入色谱进样样品管中，放-70 °C冰箱保存，待测。
   
   
2. 按照以下所描述的仪器条件准备好仪器，以便对黄酮进行检测
   2.1

   高效液相色谱条件
   流动相：A(水相)为体积比为0.04%乙酸水溶液，B(有机相)为体积比为0.04%乙酸甲醇溶液，柱温40 °C，流速0.25 ml/min；
   进样量：5 μl；
   洗脱梯度：0.1 min = 25% B；15 min = 50% B；18-23 min = 75% B；23.1 min = 25% B；33 min = stop。
   
   2.2

   质谱条件
   质谱仪：AB API 4,000 Q TRAP串联四极杆线性离子阱质谱仪。
   仪器参数：离子源：Turbo V；电离模式：ESI(+)
   
   
3. 建立一个多反应监测模式(MRM)的跑样方法，并按照(表1)内容导入所需要检测的黄酮物质
   
   表1.检测水稻叶片中常见15种黄酮的相关参数
   
   
   
4. 用已建立好的方法对要分析的样品进样跑样，完成后对结果进行分析

结果与分析

结果如图1所示，每个物质的保留时间及物质名称如表2所示


图1. 叶片中15种常见黄酮的峰图

表2.水稻叶片中15中常见黄酮的保留时间及物质名称

注意事项

1. 最终可以根据标样做标准曲线对这些黄酮进行绝对定量；也可以对峰面积进行积分从而在不同的水稻样品中进行相对定量，并进一步进行相对含量的比较和分析。
   
2. 如图2是Cyanidin 3-O-glucoside在几个常规品种剑叶中的相对含量分布，可以看出，ZS97中Cyanidin 3-O-glucoside的含量远远高于其他品种，甚至是有和无的差别，从表型观察我们也可以发现ZS97的叶缘为紫色，而其他几个品种为绿色，据报道，Cyanidin 3-O-glucoside正是导致水稻叶片颜色出现紫色最主要的物质之一。
   
   
   图2. Cyanidin 3-O-glucoside在几种常规品种剑叶中的相对含量分布

参考文献

1. Chen, W., Gong, L., Guo, Z., Wang, W., Zhang, H., Liu, X., Yu, S., Xiong, L. and Luo, J. (2013). A novel integrated method for large-scale detection, identification, and quantification of widely targeted metabolites: application in the study of rice metabolomics. Mol Plant 6(6): 1769-1780.
   
2. Gong, L., Chen, W., Gao, Y., Liu, X., Zhang, H., Xu, C., Yu, S., Zhang, Q. and Luo, J. (2013). Genetic analysis of the metabolome exemplified using a rice population. Proc Natl Acad Sci U S A 110(50): 20320-20325.