流式细胞技术检测细胞核倍性   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

 

实验原理:在特定的解离液中切碎材料后使细胞破碎,分散细胞器,进而解离出细胞核,同时解离液还可防止细胞核间相互粘连。PI染细胞核后,在一定压力下逐个通过喷嘴,进入流式照射室,细胞核所带的荧光素被激发,发射出荧光,根据荧光的发射波长,选择相应的荧光通道进行检测。最后,光信号再转化成电信号,经数据处理输入电脑,呈现出点图和峰图两种流式图谱,峰图纵坐标为粒子数,横坐标为荧光强度。由于细胞核G1期的DNA含量反映这个细胞的倍性,因此,运用流式细胞仪测定的植物核DNA含量可以间接获取细胞的倍性。生物体的单倍体基因组所含DNA总量称为C值。
实验目的:通过流式细胞仪检测特定组织中细胞核的倍性。

关键词: DNA含量, 荧光素, 细胞核倍性, C值

材料与试剂

  1. 枪头
  2. 刀片 (蓝吉列)
  3. 400目滤膜 (国产)
  4. 锡箔纸
  5. 2 ml离心管
  6. 柠檬酸
  7. Tween 20
  8. Na2HPO4·12H2O
  9. Tris
  10. Na2EDTA
  11. 四盐酸精胺
  12. KCl
  13. NaCl
  14. Triton X-100
  15. β-巯基乙醇
  16. RNase
  17. 细胞核分离缓冲液 (见溶液配方)
  18. PI染液 (见溶液配方)
  19. DAPI染液 (见溶液配方)
    注:本实验所用试剂均为进口试剂。

仪器设备

  1. 移液枪
  2. 离心机
  3. 流式细胞仪 (Backman)

实验步骤

  1. 准备实验材料:根据需要选用发芽10 d左右的幼苗,或状态良好的愈伤。
  2. 配所需试剂 (所有试剂均用进口):
    2.1
    细胞核分离缓冲液 (溶液配方1)
    2.2
    PI染液 (见溶液配方2)
    2.3
    DAPI染液 (见溶液配方3) 
  3. 将叶鞘或愈伤浸没在600 μl解离液Otto I buffer中,在冰上用刀片尽可能细地切碎,室温孵育5-10 min,用400目的细胞筛过滤到2 ml离心管中,置冰上;可以再2,000 rpm离心3 min,弃上清,再加400 μl Otto I buffer重悬细胞10 min,再加入1,000 μl Otto II buffer。
  4. 切根时将根浸没在600 μl解离液B中,在冰上用刀片小心地切靠近根尖的区段,室温孵育5-10 min,用400目的细胞筛过滤到2 ml离心管中,置冰上。
  5. 加入PI或者DAPI染液20 μl,避光染10 min。
  6. 移至上样管,立即上机检测。收集20,000个颗粒。
  7. 结果分析:通常在野生型材料中可以看到碎片峰(不对称),2C的峰(对称),以及少量4C的峰,而在一些突变体材料中可能看到显著的4C、8C或者更高倍数的峰。

注意事项

解离液和材料的用量可根据材料中核的多少而适量增减,例如愈伤中核多可适量少用些材料,而根中核较少所以可适量少加些解离液,尽量保证解离液中较高的核浓度。选择合适的解离液,不合适的解离液可能导致很高的碎片峰。取材要新鲜。

溶液配方

注:所有试剂均用进口。

  1. 细胞核分离缓冲液
    1)
    适用于从叶鞘或愈伤中分离
    Otto I buffer:0.1 M柠檬酸,0.5% (v/v) Tween 20,pH 2.3,4 °C保存
    Otto II buffer:0.4 M Na2HPO4·12H2O,pH 8.9,常温保存
    2)
    适用于从根中分离
    15 mM Tris,2 mM Na2EDTA,0.5 mM四盐酸精胺,80 mM KCl,20 mM NaCl,0.1% (v/v) Triton X-100,15 mM β-巯基乙醇,pH 7.0-8.0,-20 °C保存
  2. PI染液
    母液浓度为1 mg/ml (20x),使用浓度为50 μg/ml,用锡箔纸包裹4 °C保存。使用前加入RNase,50 μg/ml
  3. DAPI染液
    工作浓度6 μg/ml,使用前加入RNase,50 μg/ml
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:刘菊红, 李一博, 熊立仲. (2018). 流式细胞技术检测细胞核倍性. Bio-101: e1010143. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010143.
How to cite: Liu, J. H., Li, Y. B. and Xiong, L. Z. (2018). Detection of Nuclear Ploidy by Flow Cytometry. Bio-101: e1010143. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010143.
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