实验原理:双向电泳(two-dimensional electropHoresis)技术是等电聚焦和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳技术的组合,即先进行等电聚焦电泳(按照蛋白质等电点对蛋白质进行分离),然后再进行SDS-PAGE凝胶电泳(按照蛋白质相对分子量大小对蛋白质进行分离),最后经过染色得到蛋白质二维分布图,图上的每个点代表样品中的一种或几种蛋白质。 等电位聚焦(Isoelectric focusing)是一种根据分子携带的电荷不同来分离分子的技术。蛋白质同时具有酸性基团和碱性基团,在pH值低于等电点时会带有正电荷,在电场中向阴极移动(高于等电点则向阳极移动)。将蛋白质置于有递增pH梯度的凝胶中电泳,蛋白质所带电荷会一直减少,直到蛋白质移动到pH值与其等电点相同的区域。在此处,蛋白质静电荷为零,因此停止运动,最终蛋白质被“聚焦”在pH值和其等电点相同的窄带中。 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electropHoresis,简称SDS-PAGE)是一种根据蛋白质相对分子量大小来对其进行分离的电泳技术。十二烷基硫酸钠(SDS)是一种阴离子去污剂,能够断裂分子内和分子间的氢键,与蛋白质结合后破坏蛋白质的二级结构使其变性,并包覆变性蛋白质,使蛋白质所带负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量,从而消除不同蛋白质间的电荷差异和结构差异,而使蛋白质带有一致的负电荷和一致的形状。此时,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子量,而与所带电荷和分子形状无关。 实验目的:对蛋白质混合物中的蛋白质进行分离。
关键词: 等电聚焦, SDS-PAGE凝胶电泳, 双向电泳
材料与试剂
仪器设备
实验步骤
一、 三氯乙酸-丙酮沉淀法抽提水稻叶片蛋白
二、 双向电泳分离待测样品
三、 银染法对凝胶进行染色
四、 凝胶扫描及图像分析
注意事项
溶液配方
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