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蛋白质双向电泳   

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实验原理:双向电泳(two-dimensional electropHoresis)技术是等电聚焦和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳技术的组合,即先进行等电聚焦电泳(按照蛋白质等电点对蛋白质进行分离),然后再进行SDS-PAGE凝胶电泳(按照蛋白质相对分子量大小对蛋白质进行分离),最后经过染色得到蛋白质二维分布图,图上的每个点代表样品中的一种或几种蛋白质。

等电位聚焦(Isoelectric focusing)是一种根据分子携带的电荷不同来分离分子的技术。蛋白质同时具有酸性基团和碱性基团,在pH值低于等电点时会带有正电荷,在电场中向阴极移动(高于等电点则向阳极移动)。将蛋白质置于有递增pH梯度的凝胶中电泳,蛋白质所带电荷会一直减少,直到蛋白质移动到pH值与其等电点相同的区域。在此处,蛋白质静电荷为零,因此停止运动,最终蛋白质被“聚焦”在pH值和其等电点相同的窄带中。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electropHoresis,简称SDS-PAGE)是一种根据蛋白质相对分子量大小来对其进行分离的电泳技术。十二烷基硫酸钠(SDS)是一种阴离子去污剂,能够断裂分子内和分子间的氢键,与蛋白质结合后破坏蛋白质的二级结构使其变性,并包覆变性蛋白质,使蛋白质所带负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量,从而消除不同蛋白质间的电荷差异和结构差异,而使蛋白质带有一致的负电荷和一致的形状。此时,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子量,而与所带电荷和分子形状无关。
实验目的:对蛋白质混合物中的蛋白质进行分离。

关键词: 等电聚焦, SDS-PAGE凝胶电泳, 双向电泳

材料与试剂

  1. 离心管
  2. 液氮
  3. 三氯乙酸 (Trichloroacetic acid, TCA) (Sigma, USA, catalog number: T6399)
  4. 苯甲基磺酰氟 (PHenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF) (Sigma, USA, catalog number: P7626)
  5. β-巯基乙醇 (2-Mercaptoethanol) (Fluka, USA, catalog number: 63690)
  6. 二硫苏糖醇 (Dithiothreitol, DTT) (Sigma, USA, catalog number: 43815)
  7. 尿素 (Urea) (Sigma, USA, catalog number: U6504)
  8. 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS) (Sigma, USA, catalog number: C9426)
  9. Tris (ANGUS chemical company, USA, catalog number: 77-86-1)
  10. 丙酮 (Acetone) (Sigma, USA, catalog number: 650501)
  11. Protease inhibitor cocktail (Amersham Bioscience, USA, catalog number: 80-6501-23)
  12. Nuclease mix (Amersham Bioscience, USA, catalog number: 80-6501-42)
  13. 冰乙酸 (Acetic acid) (J&K scientific, USA)
  14. 甲醇 (Methanol) (Fisher scientific, USA)
  15. 乙醇 (Ethanol) (Sigma, USA, catalog number: E7023)
  16. 甲醛 (Formaldehyde solution) (Sigma, USA, catalog number: F8775)
  17. 硫代硫酸钠 (Sodium thiosulfate,Na2S2O3) (Sigma, USA, catalog number: 72049)
  18. 硝酸银 (Silver nitrate,AgNO3) (Sigma, USA, catalog number: S7276)
  19. 碳酸钠 (Sodium carbonate,Na2CO3) (Sigma, USA, catalog number: S7795)
  20. 乙二胺四乙酸 (Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA) (Fluka, USA, catalog number: 31064)
  21. Solution A (见溶液配方)
  22. Solution B (见溶液配方)
  23. Lysis Buffer (见溶液配方)
  24. 0.2 M PMSF (见溶液配方)

仪器设备

  1. EttanTM IPGpHor ⅡTM等电聚焦仪 (Amersham Bioscience, USA)
  2. EttanTM DALTtwelve System电泳仪 (Amersham Bioscience, USA)
  3. 通风橱
  4. 摇床
  5. 研钵
  6. -20 °C冰箱
  7. -70 °C冰箱
  8. 冷冻真空干燥仪
  9. 天平
  10. 移液器
  11. 振荡器

实验步骤

一、 三氯乙酸-丙酮沉淀法抽提水稻叶片蛋白

  1. 取新鲜水稻叶片,置于预冷研钵(预先于-20 °C冷冻)中,用液氮研磨成细粉末。
  2. 取200 mg细粉末,装入1.5 ml硅化处理的离心管中,加入1 ml预先于-20 °C预冷的Solution A (溶液配方1),充分振荡后,于-20 °C放置至少45 min (推荐过夜放置)。
  3. 4 °C,13,000 rpm离心15 min。
  4. 吸弃上清,加入1 ml预先于-20 °C预冷的Solution B (溶液配方2),重悬沉淀后充分振荡,于-20 °C放置1 h。
  5. 4 °C,13,000 rpm离心15 min。
  6. 吸弃上清,重复用Solution B清洗样品至沉淀颗粒无色(沉淀颜色变化为绿-黄-白)。
  7. 将样品置于冷冻真空干燥仪中干燥,之后放置于-70 °C过夜。
  8. 按1:1 (mg:ml)的比例加入Lysis Solution (溶液配方3),重悬沉淀。
  9. 室温放置1 h后于4 °C,10,000 rpm/min 离心10 min,收集上清至另一1.5 ml离心管中。
  10. 将收集的上清于4 °C,10,000 rpm/min 离心10 min后,收集上清,可提高样品质量,但样品量会有所损失。
  11. 测量浓度后将样品置于-70 °C保存。

二、 双向电泳分离待测样品

  1. 一相等电聚焦前处理按照所用仪器的厂商提供的操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10 mg/ml,否则会造成蛋白质的聚集或沉淀。一相等电聚焦于EttanTM IPGpHor ⅡTM等电聚焦仪(Amersham Bioscience, USA)上进行,仪器运行参数如下:
    Rehydration
    30 V
    12 h (20 °C)
    Grad
    100 V
    1 h
    Grad
    200 V
    1 h
    Grad
    500 V
    1 h
    Grad
    1000 V
    1 h
    Grad
    8000 V
    24,000 Vh
    Step
    8000 V
    12,000 Vh
    Step
    1000 V
    4 h (实际运行1-1.5 h)
    注:不同厂家的仪器参数会有不同,请按照厂家使用说明书进行设置。
  2. 等电聚焦完毕后(约需24 h),若不立即进行第二相电泳,胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70 °C保存数月。
  3. 等电聚焦好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后,于EttanTM DALTtwelve System电泳仪(Amersham Bioscience,USA)上用12.5% SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5 W/胶45 min,15 W/胶5-8 h,20 °C。

三、 银染法对凝胶进行染色

  1. 固定:凝胶于含5%冰乙酸和40%甲醇的溶液中放置过夜。也可于含10%冰乙酸和40%甲醇的溶液中摇晃15 min (摇床转速60 rpm)。
  2. 清洗:凝胶置于35%乙醇中摇动清洗3次 (摇床转速60 rpm),每次20 min。
  3. 增敏:凝胶置于0.02%的硫代硫酸钠中增敏2 min。
  4. 清洗:用去离子水清洗3次,每次5 min (摇床转速60 rpm)。
  5. 染色:加入0.25%硝酸银溶液染色20 min。
  6. 清洗:用去离子水清洗2次,每次1 min (摇床转速60 rpm)。
  7. 显影:加入2.5% Na2CO3溶液,迅速用手晃动至溶液呈暗黄色;之后倒掉溶液,加入含2.5% Na2CO3和0.04%甲醛的水溶液显影至凝胶上黑点出现 (黑点即蛋白点)。
  8. 定影:倒掉显影液,加入1.46% EDTA定影10 min。
  9. 水洗:去离子水洗3次,每次10 min (摇床转速60 rpm),然后将凝胶置于1%乙酸中于4 °C保存。

四、 凝胶扫描及图像分析

  1. 图像扫描:凝胶染色后采用Image scanner (Amersham Biosciences, USA)以300 dpi,16-bit模式(65536灰阶)进行扫描。
  2. 图像分析:扫描完毕后,凝胶继续置于1%乙酸中于4 °C保存。扫描后的图像用ImageMaster 2D Platinum software(Version 5.0,Institute of Bioinformatics, Swiss)软件进行分析。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以最小点面积(a minimum spot area)30,平滑度(smooth)2为主要参数最大限度检测蛋白质点。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势,目标蛋白质相邻位点的相对一致性,至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。

注意事项

  1. TCA:TCA有毒性,有刺激性气味,损害呼吸道、眼睛及皮肤,称量时应戴手套及口罩,避免沾到皮肤及吸入,若不慎接触,应立即用大量水冲洗后就医。TCA易潮解,称量时应迅速。
  2. 甲醛:有刺激性气味,易挥发,其蒸气强烈刺激粘膜、眼睛,具致癌性。使用时应戴手套及口罩,在通风橱内操作。
  3. 甲醇:有毒,能引起失明。二硫苏糖醇(DTT):很强的还原剂,散发难闻的气味。可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。当使用固体或高浓度储存液时,戴手套和护目镜,在通风橱中操作。beta-巯基乙醇:可致命,对呼吸道、皮肤和眼睛有伤害。丙酮:对神经系统有麻醉作用,并对黏膜有刺激作用。

溶液配方

  1. Solution A
    10% (w/v) 三氯乙酸
    20 mM二硫苏糖醇或0.07% (v/v) β-巯基乙醇
    1 mM PMSF
    丙酮 (配制前于-20 °C预冷)
  2. Solution B
    20 mM二硫苏糖醇或0.07% (v/v) β-巯基乙醇
    1 mM PMSF
    丙酮 (配制前于-20 °C预冷)
  3. Lysis Buffer
    8 M Urea
    4% (w/v) CHAPS
    40 mM Tris
    1% (v/v) protease inhibitor cocktail
    1% (v/v) nuclease mix
    灭菌去离子水
  4. 0.2 M PMSF
    异丙醇配制
    注:PMSF有剧毒,严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤,称量时应戴手套及口罩,避免沾到皮肤及吸入,若不慎接触,应立即用大量水冲洗后就医。PMSF溶于异丙醇后置于-20 °C长期保存,保存中易析出结晶,用前取出待结晶溶化后再使用。
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式: Readers should cite both the Bio-protocol article and the original research article where this protocol was used:
  1. 马海港, 彭波, 袁猛. (2018). 蛋白质双向电泳. Bio-101: e1010131. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010131.
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