水稻原生质体的分离及转化   

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Original research article

A brief version of this protocol appeared in:
Rice Protocol e-book

实验目的:亚细胞定位,BiFC等需要进行瞬时表达的实验。

关键词: 原生质体, 黄化苗, 酶解

材料与试剂

  1. 2 ml圆底离心管,10 ml圆底离心管
  2. 各种型号枪头 (所有与原生质体接触的枪头都要剪去尖头)
  3. 刀片
  4. 锡纸
  5. 培养皿
  6. 150目的筛子
  7. 中花11黄化苗
    注:将中花11种子按照组培方法于生根培养基中发芽,28 °C暗培养10-15天。少于10天的黄化苗叶鞘很短,细胞太小,不利于观察;而大于15天的黄化苗叶鞘由白色转为略带褐色,细胞太老,原生质体转化后活细胞很少。
  8. 质粒
    注:CsCl梯度离心纯化的质粒,或者QIAGEN plasmid Midi Kit (Catalog number: 12143)纯化的质粒
  9. KOH
  10. Cellulose RS (Yakult Honsha)
  11. Macerozyme (Yakult Honsha)
  12. PEG4000 (Fluka)
  13. BSA (Sigma)
  14. Mannitol (Sigma)
  15. KCl (Sangon)
  16. CaCl2 (BBI) 
  17. MgCl2 (Sigma)
  18. NaCl (BBI) 
  19. MES hydrate (Sigma)
  20. 2 M Mannitol (Sigma, FW: 182.17) (见溶液配方)
  21. 0.2 M KCl (Sangon, FW: 74.55) (见溶液配方)
  22. 1 M CaCl2 (BBI, FW: 147.02) (见溶液配方)
  23. 0.5 M MgCl2 (Sigma, FW: 95.21) (见溶液配方)
  24. 1.54 M NaCl (BBI, FW: 58.44) (见溶液配方)
  25. 0.1 M MES KOH, pH 5.7 (见溶液配方)
  26. MES hydrate (Sigma, FW: 195.24) (见溶液配方)
  27. 酶解液 (Enzyme solution) (见溶液配方)
  28. W5 solution (见溶液配方)
  29. MMG solution (见溶液配方)
  30. 40% PEG 4000 (见溶液配方)

仪器设备

  1. 真空泵
  2. 摇床
  3. 移液枪
  4. 可调加减速度的吊篮式冷冻离心机
  5. 计时器
  6. Confocal显微镜

实验步骤

  1. 配制酶解液,现配现用(见溶液配方7),同时准备0.6 M Mannitol (溶液配方1)。
  2. 将酶解液倒到大小合适干净的培养皿中。将暗培养10-15天的黄化苗取出,将叶鞘浸在0.6 M Mannitol中,用锋利的刀片快速切割叶鞘成1 mm以下的小段,越细越好,不要撕扯。切下的叶鞘立即转入配好的酶解液中。一般50棵黄化苗的叶鞘用10 ml酶解液酶解,可至少转化5个质粒组合。更多的转化可扩大相应反应体系。叶鞘切完毕,泡在酶解液中,抽真空5-10 min,使大部分叶鞘下沉到酶解液底部。将酶解液用锡纸包被以避光,放置在28 °C,40-50 rpm的摇床上,酶解4-5 h。酶解完成后,取一滴酶解液镜检,如果细胞圆而发亮,则健康,继续往下做;如果细胞扁且发黑,则弃去。
  3. 酶解将近完成时,配制W5 solution及MMG solution (见溶液配方8及9)
  4. 将酶解液混匀,用150目的筛子过滤到新的培养皿中,再转移至10 ml圆底离心管中。100 x g转速,加速、减速加速度为2,离心10 min,并预冷MMG溶液。
  5. 用1 ml移液枪吸走上清,可见到管底有较多黄绿色沉淀,此为健康的细胞;如果沉淀很少,或者沉淀很白,则细胞质量不好。缓缓加入4 ml W5溶液,轻轻混匀,再以100 x g转速,加速、减速加速度为2,离心10 min。
  6. 用1 ml移液枪吸走上清,缓缓加入4 ml预冷的MMG溶液,以4 °C,100 x g转速,加速、减速加速度为2,离心10 min。
  7. 用1 ml移液枪吸走上清,缓缓加入2 ml预冷的MMG溶液,轻混匀,以4 °C,100 x g转速,加速、减速加速度为2,离心10 min。计算需要原生质体的体积:200 μl x N,再多留500 μl。用移液枪吸走上清,用所需体积的MMG溶液混匀原生质体,冰浴30 min。
  8. 在冰浴期间准备:将需要转化的质粒稀释成20 μl,质粒的量为2-10 μg,加到2 ml圆底离心管中。将离心机转头换成2 ml的小转头,温度设定为室温。
  9. 配制40% PEG4000溶液 (见溶液配方10)。
  10. 将原生质体混匀,依次向2 ml离心管中 (已加入了20 μl质粒) 加入200 μl原生质体和220 μl 40% PEG4000溶液,立即轻柔上下颠倒混匀并计时。室温放置20 min。
  11. 向2 ml离心管中加入1 ml W5溶液,混匀,室温100 x g转速,加速、减速加速度为2,离心10 min。用1 ml移液枪小心吸走上清,再加1.5 ml W5,28 °C暗培养12-16 h (不要短于8 h或者超过24 h)。
  12. 观察前,以室温,100 x g转速,加速、减速加速度为2,离心10 min。吸走上部液体,仅留底部200 μl细胞。轻轻混匀,在Confocal显微镜下观察荧光。

溶液配方

  1. 2 M Mannitol (Sigma, FW: 182.17)
    36.434 g加ddH2O定容至100 ml,微波加热溶解
  2. 0.2 M KCl (Sangon, FW: 74.55)
    1.491 g加ddH2O定容至100 ml
  3. 1 M CaCl2 (BBI, FW: 147.02)
    14.7 g加ddH2O定容至100 ml
  4. 0.5 M MgCl2 (Sigma, FW: 95.21)
    4.76 g加ddH2O定容至100 ml
  5. 1.54 M NaCl (BBI, FW: 58.44)
    8.99 g加ddH2O定容至100 ml
  6. 0.1 M MES KOH, pH 5.7
    称取MES hydrate (Sigma, FW: 195.24) 1.952g加ddH2O溶解,加KOH调至pH 5.7,定容至100 ml酶解液(Enzyme solution,现用现配)
    Enzyme solution (终浓度)
    10 ml所需母液
    0.6 M Mannitol
    3 ml 2 M Mannitol
    10 mM MES (pH 5.7)
    1 ml 0.1 M MES
    Cellulose RS (1.5%)
    0.15 g
    Macerozyme (0.75%)
    0.075 g
    搅拌溶解,55 °C加热10 min,自然冷却,再加入以下试剂
    0.1% BSA
    0.01 g
    1 mM CaCl2
    10 µl 1 M CaCl2
    ddH2O
    6 ml
  7. W5 solution (100 ml)*
    W5 solution终浓度
    所需母液
    154 mM NaCl
    10 ml (1.54 M NaCl)
    125 mM CaCl2
    12.5 ml (1M CaCl2)
    5 mM KCl 
    2.5 ml (0.2 M KCl)
    2 mM MES (pH 5.7)
    2 ml (0.1 M MES, pH 5.7)
    用ddH2O定容至100 ml
  8. MMG solution*
    MMG solution终浓度
    100 ml所需母液
    0.6 M Mannitol
    30 ml 2 M Mannitol
    15 mM MgCl2
    3 ml 0.5 M MgCl2
    4 mM MES (pH 5.7)
    4 ml 0.1 M MES(pH 5.7)
    用ddH2O定容至100 ml
    *注:W5和MMG平时存放于4℃冰箱,只要没有被细菌或真菌污染,就可以继续使用。
  9. 40 % PEG 4000溶液
    40% PEG终浓度
    5 ml所需母液
    40 % PEG4000
    2g
    0.6 M Mannitol
    1.5 ml x 2 M Mannitol
    100 mM CaCl2
    0.5 ml x 1 M CaCl2
    加ddH2O至5 ml
    PEG需要用微波炉稍微加热溶解,混匀,在转化前放在37 °C温箱中保温,防止其再次凝固
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:江云鹤, 程珂, 赵晓波, 欧阳亦聃. (2018). 水稻原生质体的分离及转化. Bio-101: e1010125. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010125.
How to cite: Jiang, Y. H., Cheng, K., Zhao, X. B. and Ouyang, Y. D. (2018). Isolation and Transformation of Rice Protoplasts. Bio-101: e1010125. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010125.
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