利用荧光实时定量PCR技术进行表达谱分析   

材料与试剂

1. 实时荧光定量PCR板及膜 (ABI)
   
2. 0.6 ml及1.5 ml tubes (AXYGEN)
   
3. 20 µl、200 µl及1 ml tips (AXYGEN)
   
4. SYBR premix Ex Taq (TaKaRa)

仪器设备

1. 2.5 µl、10 µl、20 µl、200 µl、1 ml移液器
   
2. 实时荧光定量PCR仪 (ABI公司，7500实时荧光定量PCR仪)
   注：目前市面有多种实时荧光定量PCR的平台，如ABI公司的7500，罗氏公司的LightCycler 480，伯乐公司的ICycler等，本文以本实验室用到的ABI公司的7500实时荧光定量PCR仪为例进行阐述。
   
3. 离心机
   
4. 紫外分光光度计

实验步骤

1. cDNA准备，根据不同的研究目的，对水稻各个发育时期的组织进行取样，例如叶片，叶鞘，根，茎，幼穗等，进行RNA抽提和反转录得到cDNA，并用内参基因(如Actin, Ubiquitin等)对cDNA进行常规RT-PCR扩增，确保cDNA质量和浓度基本一致。
   
2. 引物设计，实时荧光定量PCR扩增片段的设计一般遵循以下原则：
   1)

   扩增片段长度在70-200bp为宜，片段越短扩增效率越高，但如果片段小于70bp，扩增片段很难与可能存在的引物二聚体区分。
   
   2)

   扩增片段应尽可能避免连续的单碱基重复和二级结构的产生。
   
   3)

   扩增片段优先考虑设计在基因的3’端。
   
   4)

   建议检测引物的扩增效率，扩增效率接近100%的扩增能够保证试验的重复性。
   
   
3. 准备反应体系，在准备好cDNA样品和引物之后，即可制备样品表。一般每个样品会设置三个重复，同时设置三个重复的内参基因对照。按如下体系配置PCR反应:
   按如下体系分别配制Mix1, Mix2和Mix3，并按先后顺序加入cDNA (Mix1),引物(Mix2)和SYBR Green I/ROX (Mix3)。每个样品设置三个目的基因和内参基因的技术重复。
   
   
   
   注：
   1)

   由于实时荧光定量PCR的检测非常灵敏，因此为了尽可能的避免人为操作的影响，可以将模版cDNA进行一定程度的稀释可以降低误差(配成Mix1，则每孔加稀释后的cDNA体积为6 µl)，但同时应确保cDNA的浓度在合适范围之内。
   
   2)

   内参基因通常会选取表达量相对稳定的持家基因进行设计，如Actin，Ubiquitin等，具体到水稻，可参见The Plant Journal，2010，A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice一文对水稻看家基因的总结。
   
   3)

   本实验针对TaKaRa公司的DRR041A SYBR premix Ex Taq试剂设计，如果用到其他公司和其他系统的试剂则具体参照试剂的使用说明进行试验。
   
   
   
4. 运行反应程序如下
   
   
   
   
5. 结果分析
   先对溶解曲线进行分析，单峰的熔解曲线被认为是合格的扩增，而出现双峰等情况则可能在扩增中出现了非特异扩增及二聚体等情况 (图1)。 
   
   
   图1. 荧光定量PCR引物溶解曲线图例
   
   
   1)

   利用2^-∆∆CT方法进行相对表达量的计算。导出文件，整理CT值，对内参基因进行样本差异的均一化：目的基因CT值-内参基因CT值=∆CT处理样品和对照样品间的相对差异比较。
   
   2)

   处理样品∆CT值-对照样品∆CT值=∆∆CT，使用以下公式计算相对表达量差异：倍数变化=2^(-ΔΔCT)_。

         生成文件，以CT值进行相对表达量的计算。

         注：计算公式及原理参考Livak等2001.

注意事项

1. 为减少技术重复间的标准误，使用确认已校准的移液器，推荐对应移液器为Real-time PCR专用。
   
2. 目的基因的CT值在20-35之间较好，如果CT值较大，说明基因表达量较低，可适当提高模板浓度。
   
3. 为了节约试剂成本，反应体系可缩减至10 µl。
   
4. 为防止机器对实验结果的影响，做Real-time PCR时务必保持PCR板的洁净，不要在PCR板侧壁做标记或在机器旁打开有荧光的物质。
   
5. Real-time PCR引物应做预实验确定其是否特异扩增。

参考文献

1. Livak, K. J. and Schmittgen, T. D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^−ΔΔCT method. Methods 25(4): 402-408.