Digestion-based SNP Genotyping Method   

材料与试剂

1. HEPES
   
2. KCl
   
3. MgSO₄
   
4. Triton X-100
   
5. BSA
   
6. 核酸酶CEL I (来自芹菜) 或者SURVEYOR^® Nuclease Kits (Transgenomic, catalog number: 706020)
   注：如果使用CEL I则需要自己制备酶的粗提物 (Till等, 2006)。
   
7. CEL I酶粗提物缓冲液 (见溶液配方)

仪器设备

1. PCR仪
   
2. 电泳仪

实验步骤

1. 设计PCR引物，使得扩增产物跨越待检测的SNP位点，按常规体系和方法进行PCR反应。在普通扩增PCR程序后面加上一步变性-退火步骤以便SNP位点异源双链DNA的形成：99°C，10 min；70 °C，20 s (70次循环，每次降温0.3 °C)；降到15 °C保存。
   
2. 为了鉴定基因型，每个样品需要进行两次PCR，一次正常操作 (不加已知亲本)，另一次混入等量的一个已知亲本的DNA再进行PCR。
   
3. CEL I酶切检测PCR产物

   PCR产物	9 μl
   CEL I	0.3 μl
   Buffer	1.5 μl
   ddH2O	4.2 μl

   45 °C反应15 min，加入3 μl，0.5 M EDTA (pH 8.0)终止反应
   
4. 常规琼脂糖电泳检测酶切产物，按照实验原理所述进行基因型判断。

溶液配方

1. CEL I酶粗提物10x缓冲液
   0.1 M HEPES pH 7.5
   0.1 M KCl
   0.1 M MgSO₄
   0.02% Triton X-100
   0.002 mg/ml BSA

致谢

感谢中国科学院植物研究所刘春明研究员对本方法体系建立所提供的帮助。

参考文献

1. Till, B. J., Zerr, T., Comai, L. and Henikoff, S. (2006). A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals. Nat Protoc 1(5): 2465-2477.